L’émergence de la pharmacorésistance multi-classes chez les personnes traitées au VIH-antirétroviraux au Sénégal: Implications pour le traitement du VIH dans l’Afrique de l’Ouest à capacité limitée

Contexte L’efficacité de divers schémas thérapeutiques antirétroviraux ARV pour l’infection par le VIH du virus de l’immunodéficience humaine reste incertaine: elle est intrinsèquement résistante aux inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse et à l’enfuvirtide et peut également être moins sensible que le VIH à certains inhibiteurs de la protéase. Les mutations du VIH qui confèrent la résistance aux ARV ne sont pas bien caractérisées Méthodes: Vingt-trois patients ont été étudiés dans le cadre d’une étude de cohorte longitudinale prospective continue sur le traitement antirétroviral au Sénégal. Les patients ont été traités avec un inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse. schémas VIH-pol de ces patients ont été génotypés, et les mutations prédictives de la résistance au VIH ont été évaluées Corrélats de la résistance aux ARV ont été analysésRésultats Multiclass mutations de pharmacorésistance NRTI et PI ont été détectés dans les souches chez% des patients; Les mutations de la transcriptase inverse MV et KR, qui confèrent une résistance élevée à la lamivudine et à l’emtricitabine dans le VIH, ont été retrouvées dans des souches de% et de% des patients, respectivement, la mutation QM, confère une résistance multinucléosidique au VIH-, apparue dans des souches chez% des patients Les mutations de l’analogue de la thymidine associées au VIH ML, DN, KR, LW et TY / F n’ont pas été observées, à l’exception de KR, qui était présent avec KR et QM dans une souche provenant du patient Huit patients avaient un VIH – avec des mutations PI associées à la résistance à l’indinavir, y compris KR, IM, VA, IF, LM, LF; les patients avaient des souches avec de multiples mutations associées à la résistance à l’IP La durée du traitement antirétroviral était positivement associée au développement d’une pharmacorésistance. P = Neuf% des patients infectés par le VIH avec une résistance aux ARV détectable présentaient des charges plasmatiques indétectables d’ARN VIH. log & gt; copies / mL, comparé à% de patients infectés par le VIH avec une résistance aux ARV détectable P = Les patients ayant un virus résistant aux ARV ont des charges plasmatiques d’ARN-VIH plus élevées, comparées à celles avec des virus non-ARV, log & gt; copies / ml [plage, & lt; se connecter & gt; copies / ml] vs & lt; log & gt; copies / ml [plage, & lt; se connecter & gt; copies / mL]; P = Conclusions Les personnes infectées par le VIH et traitées par ARV au Sénégal présentent souvent des mutations du VIH compatibles avec la pharmacorésistance multiclassique. Des études cliniques supplémentaires sont nécessaires pour améliorer l’efficacité des schémas thérapeutiques primaires et de secours dans le traitement de l’infection par le VIH.

Contrairement à l’infection par le VIH, l’infection par le VIH se caractérise par un stade asymptomatique beaucoup plus long, des charges virales plasmatiques plus faibles, une diminution plus lente de l’infection par le VIH. la numération cellulaire, la baisse du taux de mortalité associée au SIDA et les taux plus faibles d’excrétion génitale, de transmission mère-enfant et de transmission sexuelle Néanmoins, une proportion significative des infections par le VIH progresse vers le SIDA et le VIH. La thérapie antirétrovirale est de plus en plus disponible en Afrique de l’Ouest, où le VIH infecte jusqu’à un million de personnes . En Afrique de l’Ouest, de nombreux programmes de traitement antirétroviral prolifèrent. Les personnes infectées auront accès aux médicaments antirétroviraux développés contre l’infection par le VIH et y seront traités Cependant, le VIH – est intrinsèquement résistant aux inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse et Les rapports suggèrent que le VIH peut être partiellement résistant à certains inhibiteurs de la protéase et présente une faible barrière génétique à la résistance aux INTI des inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse À ce jour, aucun essai clinique randomisé n’a été mené sur le VIH. – infection Cependant, plusieurs petites études observationnelles de cohorte dans les pays développés ont montré de mauvais résultats de la thérapie ARV pour l’infection par le VIH ; Des résultats médiocres similaires ont été rapportés dans de petites études dans des pays à ressources limitées au Sénégal, en Gambie et en Côte d’Ivoire, en Afrique de l’Ouest pour évaluer l’émergence de RT-transcriptase RT et de protéases Traitement antirétroviral parmi une cohorte d’individus infectés par le VIH au Sénégal, en Afrique de l’Ouest, nous avons séquencé des gènes pol d’échantillons plasmatiques et des PBMC provenant d’une cohorte de personnes sous ARV participant au programme ISAARV de l’Initiative sénégalaise d’accès aux antirétroviraux

Patients, matériaux et méthodes

Les patients ont été étudiés dans le cadre d’une étude de cohorte longitudinale prospective en cours sur le traitement antirétroviral au Sénégal, en Afrique de l’Ouest; l ‘inscription a débuté en octobre chez les personnes infectées par le VIH et atteintes du SIDA clinique, avec un nombre de cellules CD & lt; cellules / μL, ou avec le nombre de cellules CD & lt; cellules / μL et symptômes cliniques ont été traités avec des ARV dans le cadre du programme ISAARV de l’Université de Dakar, Clinique des Maladies Infectieuses de l’Hôpital Fann Dakar, Sénégal Les patients infectés par le VIH qui initiaient un traitement ARV et ceux recevant déjà un traitement ARV dans le programme ISAARV participer à cette étude Cette étude a été menée selon les procédures approuvées par les commissions d’examen des universités de Washington et de Dakar et le Comité national sénégalais de lutte contre le sida. Tous les patients ont fourni un consentement éclairé pour la participation à l’étude. test Les échantillons de sérum ont été testés en utilisant une plaque micropuits HIV- / HIV-EIA Genetic Systems; la positivité de l’échantillon de sérum a été confirmée en utilisant un immunodosage membranaire rapide à base de peptide synthétique Multispot; Sanofi Pasteur, qui a classé les patients comme séropositifs pour le VIH ou le VIH ou comme séropositifs au moment de l’enrôlement et des visites de suivi subséquentes, puis tous les mois, les patients ont subi un examen physique et ont répondu à des questions sur les caractéristiques démographiques et comportements sexuels et autres Un historique médical de routine a été enregistré et un examen a été effectué; Les échantillons de sang périphérique ont été recueillis dans des tubes contenant de l’EDTA et ont été analysés à l’aide de l’analyseur FACSCount Becton Dickinson Biosciences afin de déterminer le nombre de cellules CD, CD et CD en tant que cellules / μL. de sang; les échantillons ont également été utilisés pour les dosages quantitatifs du VIH-ARN et le génotypage pol. Le test RT-PCR quantitatif en temps réel utilisé pour tester les taux plasmatiques d’ARN VIH, le génotypage du polype du VIH et l’analyse phylogénétique est décrit en annexe. seulement [Annexe] Analyse statistiqueHIV- Les analyses de charge ont été effectuées sur des valeurs log-transformées avec l’utilisation du test de Wilcoxon avec une limite de détection de copies / mL log & gt; Une analyse de sensibilité de l’utilisation d’une limite de détection fixée à ou copies / mL n’a pas changé le résultat que les charges virales étaient significativement plus élevées chez les patients avec des souches de virus présentant une résistance aux ARV que chez les patients avec souches de virus sans preuve de résistance aux ARV Le logiciel JMP, version SAS Institute, a été utilisé pour les calculs statistiques

Résultats

Les caractéristiques démographiques, cliniques et virologiques de base des patients rapportés dans cette étude sont présentées dans le tableau La majorité des patients ont été traités par zidovudine AZT, lamivudine TC et indinavir, qui est le traitement de première intention de l’infection par le VIH au Sénégal. les patients recevaient un traitement antirétroviral à l’entrée dans l’étude, durée médiane du traitement, jours; gamme, – jours; Les antirétroviraux étaient-ils naïfs à l’inclusion et ont-ils commencé un traitement antirétroviral pendant la période de suivi? Le génotypage du VIH-pol RT et PR a été effectué à l’entrée dans l’étude puis prospectivement tous les mois, indépendamment de la charge plasmatique du VIH. peut survenir à de faibles charges virales et pourrait affecter la capacité virale Onze% des patients avaient des souches virales sans preuve de mutations de résistance aux médicaments dans la PR ou la RT à l’entrée ou pendant la période de suivi Onze patients recevaient un traitement ARV à l’étude entrée; des souches de virus présentant des signes de pharmacorésistance à l’entrée de l’étude, une souche virale qui a développé une résistance aux médicaments pendant la période de suivi et des souches de virus qui n’ont pas développé de résistance au médicament pendant la période de suivi. étudier l’entrée et a commencé la thérapie ARV pendant la période de suivi; Aucun de ces patients n’avait de virus pharmacorésistant à l’entrée de l’étude et présentait des souches de virus qui ont développé une résistance aux médicaments pendant la période de suivi.

Les caractéristiques démographiques, cliniques et virologiques des patients infectés par le VIH recevant un traitement ARV antirétroviral à l ‘entrée de l’ étudeTable View largeTélécharger les caractéristiques démographiques, cliniques et virologiques des patients infectés par le VIH recevant un traitement antirétroviral aux mutations de l ‘entréeRT associée à la résistance aux INTI dans les mutations du VIH KR, QM, et MV dans RT ont été précédemment montrés être associés à la résistance phénotypique NRTI dans HIV- La mutation RT MV, qui confère une résistance élevée à TC et emtricitabine FTC dans le VIH-, a été trouvée en% du tableau des patients Cinq patients présentaient des souches virales avec la mutation MV au génotypage initial à l’entrée de l’étude, et des souches virales qui ont développé la mutation pendant la période de suivi La mutation HIV-RT QM qui confère la multinucléoside à l’AZT, La didanosine, la stavudine et le FTC ont été trouvés dans les souches virales de% des patients, les deux mutations étaient présentes à l’entrée de l’étude. La mutation RT KR, qui confère une résistance à TC, FTC et didanosine, a également été retrouvée dans des souches provenant de patients ayant également un virus porteur de la mutation QM, et les deux mutations étaient présentes à l’entrée de l’étude; les autres patients avaient un virus avec une population mixte KK / R émergent pendant la période de suivi

figure supplémentaire disponible sur http: // ubikmullinswashingtonedu / publications / gottlieb__CIDPR mutations associées à la résistance aux antirétroviraux dans le VIH-La contribution des mutations individuelles du VIH-PR qui confèrent une résistance phénotypique aux IP n’a pas été définie; cependant, l’émergence de mutations KR, GN, KR, MI, VA, IM, VA, IV, VI, IF / L, IV, LM, et LF dans PR chez les personnes VIH-recevant une thérapie à base d’IP ont été observées dans Étant donné que les patients de notre cohorte étaient exclusivement traités par l’indinavir pendant l’étude, nous nous sommes concentrés sur les mutations du VIH-PR KR, IM, VA, IF, LM et LF, qui ont été associées à la résistance phénotypique à l’indinavir antérieurement, bien que études limitées Huit des patients présentaient des souches virales avec des mutations PI KR, IM, VA, IF, LM et LF suggérant une résistance à l’indinavir; de ces patients avaient des souches de virus qui hébergeaient plusieurs mutations PI KR-LF, KK / R / G-IM-II / F, II / F-LL / F, et VA-LF tableau Trois patients avaient des souches avec la mutation I → F émerger pendant la période d’étude; K → R, L → M et L → F ont également émergé dans les souches virales chez des patients individuels pendant la période d’étudePermiques de PCR associées à la résistance aux antirétroviraux – mais avec un effet incertain sur les polymorphismes VIH-PR naturels associés au PI la résistance au VIH était courante; majeures VI / L, MI / V et IV et mineures LV / I, EG / R, QE, AV / I, et GA / T PI résistance aux mutations ont été trouvés chez tous les patients Ces combinaisons de mutations dans le VIH- permettrait de prédire la résistance intermédiaire atazanavir, darunavir, fosamprénavir, indinavir, lopinavir, nelfinavir, saquinavir et tipranavir en utilisant l’algorithme de Stanford HIV Drug Resistance Database Les données phénotypiques sur les souches VIH-ROD suggèrent que ces polymorphismes naturels confèrent une résistance de & gt; comparé aux souches VIH, au moins amprenavir, atazanavir et tipranavirHIV-PR polymorphismes de signification incertaineHIV- polymorphismes non connus pour être associés à la résistance aux antirétroviraux dans le VIH ou le VIH- ont été fréquemment rapportés dans les souches virales des deux ARV Patients naïfs et expérimentés en thérapie De nombreux sites polymorphiques de signification imprécise pour la résistance aux IP chez les patients VIH ont été observés dans notre cohorte; aucun de ces sites n’a semblé émerger dans les souches virales de & gt; patient, ce qui suggère que les virus étaient peu susceptibles d’être sous pression sélective des données d’indinavir non montrées; figure supplémentaire disponible sur http: // ubikmullinswashingtonedu / publications / gottlieb__CIDMulticlass résistance aux médicaments à un INTI et un IP a été détecté dans les souches virales de% des patients et dans les souches virales de% des patients avec un tableau de virus pharmacorésistant Virus résistants, ont eu des souches de virus dans lesquelles les mutations NRTI et PI ont émergé pendant la période de suivi, et le patient avait des souches de virus avec des mutations RT MV et PR IM à l’entrée de l’étude qui ont développé des mutations KK / R / G et II / F pendant la période de suivi Six des patients avaient des souches virales avec des mutations de résistance aux médicaments liées à la RT et à la PR sur le même clone viral, ce qui suggère que ces virions étaient multirésistants aux médicamentsNous cherchions à déterminer si HIV-NRTI et / ou PI la résistance était associée à la durée du traitement. En% des patients qui avaient des souches virales sans preuve de mutations de résistance aux médicaments, la durée médiane de l’exposition au traitement antirétroviral était de plusieurs jours. ge, – jours Sept patients avaient des souches de virus avec des signes de résistance aux médicaments à la durée médiane d’entrée de l’étude de l’exposition au traitement antirétroviral, jours; intervalle, – jours, et avait des souches de virus qui ont développé une résistance aux médicaments pendant la période de suivi durée médiane de l’exposition au traitement antirétroviral, jours; intervalle, – jours La durée de la thérapie antirétrovirale était plus longue chez les patients ayant des souches virales sans résistance aux médicaments que chez les patients présentant des souches virales résistantes aux médicaments, jours vs jours; P =, par Wilcoxon test de la somme de rangs Il semble y avoir une tendance à la pharmacorésistance multiclassique avec une durée accrue jusqu’à la première détection de résistance aux médicaments, bien que potentiellement confondue avec les patients avec des souches virales avec une résistance détectable aux médicaments. patient HA qui avait initialement reçu un diagnostic erroné de l’infection par le VIH et, par conséquent, n’a reçu que des INTI actifs AZT et TC et le VIH – inactivation des charges d’ARN du VIH plasmatique de la table de névirapine & lt; copies / ml; log & gt; copies / ml en% de patients avec souches virales sans résistance ARV détectable, comparé avec% de patients souches virales avec résistance ARV détectable P =, par test exact de Fisher En outre, les patients infectés par virus ARV-résistants avaient des charges plasmatiques VIH-ARN plus élevées médiane, log & gt; copies / ml; plage, & lt; se connecter & gt; copies / ml, comparé à ceux avec des souches virales sans preuve de résistance médiane aux antirétroviraux, & lt; copies / ml; plage, & lt; se connecter & gt; copies / ml; P =, par Wilcoxon test de la somme des rangs Figure

Vue de la figure grandDownload slide Charges de VIH-ARN plasmatiques chez les patients avec et sans résistance antirétrovirale aux antirétroviraux Les données de charge virale étaient log & gt; Les cercles de données brutes et les boîtes à moustaches transformées sont montrés Neuf pour cent des patients avec des souches virales sans résistance détectable aux ARV et% des patients avec des souches virales avec une résistance aux ARV détectable présentaient des charges d’ARN-VIH indétectables; & lt; log & gt; copies / ml; set to; Figure View largeTélécharger slideCharge du VIH-ARN plasmatique chez les patients avec et sans résistance aux ARV antirétroviraux Les données de charge virale étaient log & gt; Les cercles de données brutes et les boîtes à moustaches transformées sont montrés Neuf pour cent des patients avec des souches virales sans résistance détectable aux ARV et% des patients avec des souches virales avec une résistance aux ARV détectable présentaient des charges d’ARN-VIH indétectables; & lt; log & gt; copies / ml; L’analyse phylogénétique des séquences pol a révélé que des patients hébergeaient des souches du groupe A du VIH, et que le patient était infecté par un patient du groupe B du VIH. HA Figure 2 patients HA et HA étaient infectés par des souches étroitement liées, bien que Seul le partenaire a été infecté par un virus avec des signes de résistance aux ARV Figure de mutation MM / V

Figure Vue largeTélécharger Diagramme Arbre généalogique des séquences d’acides aminés du gène VIH-pol Les séquences clonales des souches virales des patients sont représentées Les mutations de résistance à la transcriptase inverse et à la protéase dans le VIH sont représentées Vingt-deux des patients ont été infectés par le VIH – souches du groupe A, et patient infecté par une souche du groupe B du VIH. Deux patients infectés par des virus étroitement liés HA et HA [grise] ont été mariés VIH – séquence de référence VIH – ROD numéro d’accession ASNROD M est montré WT, type sauvage non Mutations RT ou PRFigure View largeTélécharger Diapositive arbre phylogénétique des séquences d’acides aminés du gène VIH-pol Les séquences clonales des souches virales des patients sont montrées Les mutations de la transcriptase inverse et de la protéase dans le VIH sont représentées Vingt-deux des patients infectés par des souches du groupe A du VIH, et le patient a été infecté par une souche du groupe B du VIH. Deux patients infectés par des virus étroitement liés HA [gris] ont été mariés VIH-séquence de référence VIH-ROD ASNROD numéro d’accession M est montré WT, type sauvage pas de RT ou de mutations PR

Discussion

Une mutation KR a également été observée chez des patients infectés par un virus résistant aux INTI et associée à une résistance à TC et FTC. Un rapport récent suggère que KR peut être associé à une résistance à l’abacavir chez les patients VIH, mais les patients de ce rapport avec le virus de la mutation KR a également reçu AZT et TC Le VIH-PR contient des polymorphismes naturels qui sont communément associés à la résistance aux IP dans le VIH- VIH de type sauvage semble être naturellement moins sensible à certains IP. , l’amprénavir dans les tests de phénotypage PBMC [,,] et in vitro avec HIV-PR purifié Les données de sensibilité pour les autres IP ont été moins cohérentes Desbois et al ont rapporté une sensibilité diminuée pour l’amprénavir, l’atazanavir, l’indinavir, le nelfinavir, et le tipranavir dans le VIH-, comparé au VIH-Rodes et al ont rapporté une sensibilité réduite au repliement du nelfinavir et à l’amprénavir dans l’isolat du VIH, comparé au VIH- Witvrouw et al ont rapporté des souches du VIH du groupe A ROD wi une sensibilité réduite à l’amprénavir et au nelfinavir, mais des souches de VIH du groupe B EHO avec une sensibilité réduite à l’amprénavir mais une hypersensibilité au saquinavir, par rapport au VIH-III> Brower et al. ont rapporté que le lopinavir, le saquinavir, le tipranavir et le darunavir sur la base de leur constante d’inhibition, les valeurs de K & gi mesurées avec le PR purifié VIH-ROD et un substrat polypetide Adje-Toure et al. ont rapporté que le VIH d’une cohorte en Côte d’Ivoire semblait cliniquement résistant au nelfinavir. L’indinavir est actuellement le IP de première intention pour le traitement de l’infection par le VIH au Sénégal et était le seul traitement PI utilisé dans notre étude. Une résistance phénotypique à l’indinavir a été rapportée avec les mutations KR, IM, IL / F, VA-LF et LM ; notre étude fournit une corrélation in vivo pour cette observation Un patient patient HA dans notre étude a été infecté par une souche VIH du groupe B; la majorité des séquences du groupe B du VIH chez les patients naïfs de thérapie antirétrovirale présentent des mutations KR et LF naturellement présentes, bien qu’au moins décrit des patients naïfs de la thérapie antirétrovirale avec des souches VIH du groupe B avec la mutation L “Colson et al [ ] ont rapporté que les mutations KR et LF surviennent plus fréquemment pendant le traitement PI, et Ntemgwa et al ont rapporté la sélection pour la LF par l’indinavir et le nelfinavir dans les souches du groupe A du VIH en culture M’Barek et al ont rapporté l’introduction de la LF au VIH. Aucune donnée sur la résistance phénotypique KR ou LF n’est disponible pour les souches du groupe B du VIH. La détection de la résistance au VIH dans notre étude était associée à une plus longue durée de traitement ARV Vergne et al. ont rapporté que la résistance aux antirétroviraux dans une cohorte VIH-Sénégalais est apparue à un intervalle médian et des mois après l’entrée dans l’étude chez des patients expérimentés en thérapie antirétrovirale et chez des patients naïfs d’antirétroviraux, respectivement. y ne semble pas être sensiblement différent des jours que nous avons observés globalement pour notre cohorte, mais peut être plus long que la durée pour les patients infectés par un VIH sensible aux ARV- à l’entrée de l’étude qui a développé des mutations de résistance aux ARV durée médiane de la thérapie, jours [mois]; range, – days Malgré la présence fréquente de multiples mutations de résistance, les charges plasmatiques de VIH étaient relativement faibles, log & gt; copies / mL, bien que plus élevé que les charges plasmatiques du VIH chez les patients avec des souches de virus sans médiane de résistance aux antirétroviraux, & lt; log & gt; copies / mL [indétectable] Cette constatation est cohérente avec les charges virales relativement faibles observées chez les patients infectés par le VIH non traités, même lorsque le nombre de cellules CD est faible, mais peut également refléter une capacité de réplication supplémentaire et / ou une altération de la condition physique par mutations de résistance [,,,,] Ces résultats sont en contraste avec ce qui a été observé dans le VIH, où l’émergence de la résistance aux ARV est typiquement associée à une augmentation relativement rapide de la charge plasmatique du VIH. Le VIH est commun à faible charge virale suggère que la surveillance de la charge virale comme un signe avant-coureur de la résistance aux ARV et échec virologique peut être d’une valeur limitée pour les personnes infectées par le VIH recevant un traitement antirétroviral. peut être pauvre chez les individus traités par le VIH-infection Par conséquent, des méthodes plus fiables pour évaluer l’efficacité du traitement de l’infection par le VIH sont n En résumé, les personnes infectées par le VIH et traitées par INTI et indinavir au Sénégal développent fréquemment des mutations de la RT et du PR qui sont compatibles avec le développement de la pharmacorésistance multiclassique. Les schémas thérapeutiques primaires et de sauvetage efficaces pour l’infection par le VIH restent à déterminer et des essais contrôlés randomisés bien conçus qui démontrent quels traitements ARV sont efficaces pour traiter l’infection par le VIH sont nécessaires de toute urgence pour guider les patients et les cliniciens qui en prennent soin

Remerciements

Nous remercions les participants à l’étude et les autres membres de la collaboration Université de Washington-Sénégal: Donna Kenney, Brad Preston, Jacques Ndour, Fatou Niasse, Habibatou Diallo Agne, Ndeye Rokhaya Fall, Sophie Chablis, Marie Pierre Sy, Mame Dieumba, Bintou Diaw, Mbaye Ndoye, Khady Diop, Amadou Bale Diop, Cheikh Gueye, Boubacar Diamanka, Marianne Ndiaye, Marie Cissé Thioye, Fatou Cissé, Madeleine Mbow, Marianne Fadam Diomé et Marie Diedhiou. Soutien financier Institut national des allergies et des maladies infectieuses, National Institutes of Health à GSG et NBK et l’Université de Washington Centres de recherche sur le SIDAConflits d’intérêts potentielsTous les auteurs: pas de conflits

annexe

Détection quantitative de la charge de VIH-ARN plasmatique

Une version modifiée du test de RT-PCR quantitative en temps réel décrit par Zheng et al a été utilisée pour tester les charges plasmatiques de VIH-ARN. En bref, un échantillon de plasma -mL d’un patient infecté par le VIH ou un sérum dilué en série. Plasma VIH-VIH négatif, souche NIH-Z; microscope électronique compté à × particules virales / mL [× copies d’ARN du VIH / mL]; Immédiatement, μL de surnageant a été prélevé avec précaution et l’ARN viral a été extrait à l’aide du minikit d’ARN viral QIAmp de QIAGEN, selon les instructions du fabricant, jusqu’à un volume final de μL d’ARN-VIH. et les échantillons de patients ont ensuite été quantifiés en triple en utilisant un test RT-PCR en une étape en temps réel en utilisant un ABI HT avec le kit Qiagen QuantiTech Probe RT PCR Le volume total du mélange réactionnel était de μL, y compris × master mix μL, RT μL, μmol / L mélange d’amorce μL, μmol / L sonde μL, dHO μL, et ARN-ARN matrice μL Les conditions de cycle étaient ° C pour min et ° C pour min, cycle ° C pour s, puis ° C pour min pour les cycles, les amorces spécifiques à la séquence du VIH-LTR et les sondes pour le VIH ont été l’amorce directe ‘-GCG-GAGAGGCTGGCA-GAT-‘, l’amorce inverse ‘-GAA-CACCCAGGCTCTACCTG-CTA-‘ et la sonde ‘-FAM-AGA-GAACCTCCC -AGG-nfqMGB- ‘Les charges virales ont été quantifiées en utilisant une courbe rd définie par les étalons de VIH dilués en série -, copies / mL Il y a une limite théorique de détection de copies / mL de copie par PCR basée sur le schéma de dilution Une limite de détection des copies / mL a été utilisée sur la base de & gt; % des étalons détectés à ce niveau La plage linéaire était de & gt ;, copies / ml À copies / ml, le coefficient de variation intra-essai était%, et le coefficient de variation inter-essai était% At, copies / mL, le coefficient de variation intra-essai était de%, et le coefficient de variation inter-essai était de%

Génotypage VIH-pol

Des échantillons de sang total ont été recueillis dans des tubes EDTA pourpre. Un ADN de PBMC purifié a été obtenu en utilisant le kit QIAamp DNA Blood Mini. L’ARN-VIH Qiagen a été purifié à partir du plasma avec l’utilisation du QIAamp Viral RNA Mini Kit. amplifier les séquences de pol-VIH en utilisant une dilution limitant le point final pour éviter le rééchantillonnage, comme décrit ailleurs Le fragment de gène nt-VIH; la région codante complète de PR et les acides aminés de RT ont été amplifiés avec les jeux d’amorces suivants: Pour le premier tour, DJA- ‘-TGT GTC AGG ATG TAC AAC CCG ACC AA-‘; nt – de VIH -> ROD et DJA – ‘TGT ATA GCT TCC CCT TTC TGT TGA CAT TG-‘; nt – de VIH-> ROD Pour le second tour, le VIH- ‘RT’ -CTA CTT CCT GGT TAC CCC CTA TGC CTT TGT G- ‘; nt – de VIH-> ROD et GGH-PR ‘-GGG AAA GAA CCG CCG CAA CTT C-‘; nt – of HIV -> ROD Un sous-ensemble de séquences a été amplifié en utilisant des amorces dirigées PR ou RT, comme suit: les amorces de premier tour spécifiques au VIH-PR utilisées étaient PR ‘-GGG AAA GAA GCC CCG CAA CTT C- ‘Et PR’ -GGG-TATTATAAGGATTAGT-TGG- ‘; les amorces de second tour étaient PR ‘-GCT-GCACCTCAATTCTCT-CTT-‘ et DP ‘-TAG-ATTTAATGACATGCC-TAA-‘ Les amorces de premier tour spécifiques de HIV-RT utilisées étaient RTC ‘-ATG-ACAGGGGATCCCCCAATCAAT-ATTT- TTG- ‘et RT’ -GAA-GTCCCAGTCTGGGATCCATGT-CACTTG-CCA- ‘; les amorces du second cycle étaient RT ‘-GAG-GCATTAAAAGAGATCTGTGAA-AAAA-TGG-‘ et RT ‘-TCC-CCAAATGACTAGTGCTTCTTT-TTCC-TAT-‘ Le génotypage du VIH-pol a été tenté sur tous les échantillons disponibles indépendamment de la charge plasmatique du VIH. Des procédures de sauvegarde, incluant l’aliquotage de tous les réactifs et la séparation physique du traitement des échantillons et des étapes de manipulation post-PCR ont été incluses dans chaque expérience PCR pour tester la contamination par transfert, et des amplifications avec des équivalents-génomes de Le VIH-pROD a été utilisé comme un contrôle interne pour surveiller l’efficacité de la PCR. Les produits de PCR ont été clonés et séquencés en utilisant des méthodes de terminaison de chaîne didésoxy standard.

Analyse phylogénétique

Toutes les séquences ont été évaluées pour la confusion potentielle des échantillons et la contamination comme décrit dans les Bases de données sur les séquences du VIH http: // wwwhivlanlgov / content / sequence / TUTORIALS / CONTAM / contam_mainhtml Les séquences du VIH étaient alignées avec les séquences de référence de la base de données VIH du Laboratoire national de Los Alamos : // hiv-weblanlgov / avec utilisation de CLUSTALW, suivi d’un ajustement manuel avec utilisation de MacClade, version Les méthodes de jointure de voisin et de maximum de vraisemblance ont été utilisées pour estimer les arbres phylogénétiques avec PAUP *, les séquences VIH de version b ont été assignées aux sous-types de groupes “Sur la base des analyses phylogénétiques précitées

Analyses génotypiques de résistance aux ARV

Les séquences nucléotidiques PR et RT ont été traduites en séquences d’acides aminés avec des cadres de lecture ouverts dans MacClade, version Les changements d’acides aminés connus ou soupçonnés de conférer une résistance aux ARV dans les souches VIH ou les positions correspondantes dans les souches VIH ont été évalués http: // hivdbstanfordedu / et l’algorithme de l’International AIDS Society-USA http: // wwwiasusaorg / resistance_mutations / mutations_figurespdf En outre, nous avons utilisé le programme InSites http: // indramullinsmicrobiolwashingtonedu / cgi-bin / InSites / indexcgi pour évaluer les preuves d’émergence des polymorphismes associés à la résistance aux ARV

Chiffres supplémentaires

Analyse des sites d’acides aminés polymorphes dans RT et PR a été réalisée en utilisant InSites http: // indramullinsmicrobiolwashingtonedu / cgi-bin / InSites / indexcgi VIH-RT et PR consensus, VIH-ROD, et les patients sont présentés sites d’acides aminés polymorphes, leur position protéique , et leurs changements respectifs du consensus sont affichés dans les colonnes Les changements privés uniques sont montrés dans la colonne de droite données non montrées; chiffres supplémentaires disponibles sur http: // ubikmullinswashingtonedu / publications / gottlieb__CID