L’échec du traitement par l’azithromycine chez les patients positifs à Mycoplasma genitalium atteints d’urétrite non gonococcique est associé à une résistance induite aux macrolides

ContexteMycoplasma genitalium est une cause fréquente d’urétrite non gonococcique Des essais de traitement ont montré que la doxycycline est inefficace, alors qu’un traitement de 5 jours par l’azithromycine éradique la bactérie chez 95% des hommes infectés Le but de l’étude était d’établir la cause des échecs Sept souches de génitalium isolées chez des hommes ayant présenté un échec du traitement par l’azithromycine ont été testées pour leur sensibilité in vitro aux macrolides en utilisant une méthode de culture cellulaire gériatrique. La base génétique de la pharmacorésistance a été établie en séquençant des parties du gène de l’ARN ribosomique 23S et des gènes. codant les protéines L4 et L22 Neuf séries d’échantillons obtenus avant et après traitement chez des patients ayant présenté un échec du traitement par l’azithromycine ont été examinées en utilisant le séquençage de produits de réaction en chaîne par polyméraseRésultats Les 7 souches isolées chez des patients ayant présenté un échec azithromycine concentrati On a retrouvé 8 μg / mL pour l’azithromycine et l’érythromycine Trois mutations différentes aux positions 2058 et 2059 La numération des Escherichia coli dans la région V du gène de l’ARNr 23S Parmi les 9 patients avec des échantillons obtenus avant et après traitement, seulement 2 avaient un échantillon initial dans lequel la mutation était présente, indiquant que la pharmacorésistance était induite par un dosage inapproprié de l’azithromycine. Conclusion Le développement de la résistance aux macrolides était corrélé avec l’échec du traitement par l’azithromycine subséquente. La base génétique de la pharmacorésistance était des mutations dans la région V du gène de l’ARNr 23S, qui est bien décrit dans d’autres Mollicutes Ces résultats soulèvent des inquiétudes quant à l’utilisation du traitement à l’azithromycine à dose unique de l’urétrite non gonococcique d’étiologie inconnue

Mycoplasma genitalium est une cause fréquente d’urétrite nongonococcique aiguë et chronique, principalement chez les patients sans infection à Chlamydia trachomatis [1]. Elle est également associée à la cervicite féminine [2], à l’urétrite [3] et à l’endométrite [4]. un échantillon tubaire provenant d’une femme ayant une salpingite confirmée par laparoscopie [5] Des études de sensibilité in vitro ont jusqu’à présent montré que tous les isolats de M genitalium testés sont très sensibles aux macrolides, l’azithromycine ayant la plus faible CMI; les quinolones et les tétracyclines se sont révélés moins actifs contre M genitalium à l’exception de la moxifloxacine, qui semble être active contre toutes les souches examinées [6] Des essais thérapeutiques ont montré que la doxycycline est inefficace pour éradiquer l’infection [7-9] , alors qu’un traitement de 5 jours à l’azithromycine éradique la bactérie chez 95% des patients [9] L’azithromycine, administrée en dose unique de 1 g administrée immédiatement, semble être moins efficace, éradiquant la bactérie chez environ 85% des patients, cette différence n’a pas atteint la signification statistique [8, 9] Cependant, dans une étude australienne, 28% des patients ont présenté une rechute ou une urétrite persistante après traitement par l’azithromycine, une dose unique de 1 g administrée immédiatement [10]. échec expérimenté du traitement par l’azithromycine5 5 56% des 9 avaient des partenaires sexuels en Asie du Sud-Est, contre 6 26% des 23 patients atteints d’infections qui étaient sensibles au traitement par l’azithromycine tous les patients ayant eu un échec du traitement par l’azithromycine ont été guéris [10] Des échantillons prélevés chez 4 des patients australiens ayant eu un échec thérapeutique ont été collectés pour la culture lorsque les patients ont été examinés à la clinique des maladies sexuellement transmissibles et 3 spécimens ont été testés. collectés sur des patients similaires en Scandinavie Les 7 échantillons ont donné des isolats de M genitalium résistants aux macrolides avec des types distincts de MgPa 1-3 [11], qui indiquaient que chacune des souches était unique Le but de l’étude était d’établir la raison du traitement occasionnel échec

Patients, matériaux et méthodes

Patients et échantillons Une étude cas-témoins de NGU a été réalisée de mars 2004 à mars 2005 au Melbourne Sexual Health Center, Australie [12]. Dans cette étude, 9 hommes ont présenté un échec thérapeutique avec une dose unique de 1 g d’azithromycine donnés immédiatement, qui ne présentaient aucun risque de réinfection et pour lesquels des échantillons d’urine de prétraitement et de post-traitement étaient disponibles pour des études PCR. Des prélèvements urétraux post-traitement ont été collectés spécifiquement pour l’isolement de M genitalium chez 4 de ces hommes. à Oslo, en Norvège, ou à Stockholm et à Kristianstad, en Suède, pour le traitement des NGU et qui ont subi un échec du traitement par l’azithromycine; Les antécédents de traitement et les résultats des tentatives d’isolement de M genitalium sont résumés dans le tableau 1. Les patients ont subi un examen clinique et des échantillons d’urine de premier vide ont été analysés pour C trachomatis selon la procédure standard du laboratoire local et examinés pour M genitalium par PCR Des échantillons d’urine ont été testés pour M genitalium à Melbourne, en Australie, en utilisant un test de PCR en temps réel ciblant le gène ARNr ribosomal 16S, comme décrit par Yoshida et al [13], tandis que des échantillons d’urine et de Les patients scandinaves ont été examinés avec un PCR conventionnel avec un contrôle interne de l’inhibition ciblant le gène de l’ARNr 16S [14] Tous les résultats positifs ont été confirmés par l’utilisation d’un test indépendant ciblant le gène MgPa mgpB [15] reçu des instructions concernant la notification du partenaire et le risque de réinfection, et on leur a demandé de revenir pour une visite de test de guérison 4-6 semaines après traitement Des échantillons de culture de M genitalium ont été prélevés sur écouvillon urétral transporté dans du bouillon de mycoplasme SP4. Les spécimens australiens ont été transportés sur de la neige carbonique, tandis que les spécimens de Scandinavie ont été envoyés par courrier au Statens Serum Institut de Copenhague. Les cultures de cellules Vero ont été réalisées essentiellement comme décrit ailleurs [16, 17] Les comités d’éthique locaux ont approuvé les études à partir desquelles les patients ont été recrutés

Tableau 1View largeTéléchargement slide Historique des antécédents et statut d’isolement des souches de Mycoplasma genitalium isolées chez des patients atteints d’urétrite non gonococcique inscrits dans une étude sur l’échec du traitement par l’azithromycineTable 1View largeDownload slideTraitement Historique et statut d’isolement des souches de Mycoplasma genitalium isolées de patients atteints d’urétrite non gonococcique participant à une étude de traitement à l’azithromycine En plus des souches génitales 7 M isolées chez des patients n’ayant pas répondu au traitement par l’azithromycine, 7 souches génétiquement distinctes précédemment isolées au Statens Serum Institut ont été incluses dans le tableau de l’étude 2 Ces souches étaient très sensibles à l’azithromycine et ont été inclus pour la comparaison

Tableau 2Voir des micromicroscopes à large diffusion pour des agents antimicrobiens sélectionnés, tels que déterminés par la méthode de culture cellulaire, pour 7 souches de Mycoplasma genitalium isolées chez des patients atteints d’urétrite non gonococcique qui ont présenté un échec du traitement à l’azithromycine et 7 souches sensibles pour des agents antimicrobiens sélectionnés. méthode de culture cellulaire, pour 7 souches de Mycoplasma genitalium isolées de patients atteints d’urétrite non gonococcique ayant subi un échec de traitement à l’azithromycine et 7 souches sensibles Test de sensibilité aux antimicrobiens Des tests de sensibilité aux antimicrobiens ont été réalisés en cultivant M genitalium en présence de différentes concentrations d’antibiotiques en culture cellulaire Vero. a été contrôlée par une PCR TaqMan quantitative, comme décrit ailleurs [6, 18] Les CMI ont été déterminées pour l’érythromycine Sigma, l’azithromycine Groton Laboratories, Pfizer, la clarithromycine Abbott Laboratories, la doxycycline Sigma, la tétracycline Fluka, ciprofloxacine Bayer Health Care, lévofloxacine Daiichi Sankyo pharmacologie, et moxifloxacine Bayer Health CareAnalyse des gènes médiateurs de la résistance aux macrolides Deux fragments chevauchants du gène ARNm M genitalium 23S ont été amplifiés en utilisant des amorces Mg 23S-2024f 5′-TGAAATCCAGGTACGGGTGAAGAC-3 ‘avec Mg 23S-2682r 5’-CGGTCCTCTCGTACTAGAAGCAAAG-3 ‘et Mg 23S-1986f 5′-GTGTAACCATCTCTTGACTGTCTCGG-3′ avec Mg 23S-2171r 5’-TTCACATCAACAAATCCTTGCGA-3 ‘Un fragment de 670 paires de bases contenant le gène L4 complet a été amplifié avec l’amorce Mg L4-4f 5’-AAGTAATGGCTAAACTTAAAGTAATCC-3 ‘et Mg L41r 5′-TTTAAGAGTATGTTGGTTACATCCATAG-3′ Un fragment de 560 paires de bases contenant le gène complet M genitalium L22 a été amplifié avec Mg L22-70f 5’-ATGGTAGGTCATAAGTTGGGTGAGTTT-3 ‘et Mg L2255r 5’- AGTTCTTATTAATGCCAAACCTTAAGCC-3 ‘Les fragments amplifiés ont été purifiés et séquencés en utilisant le kit de séquençage ABI Big Dye, version 11, et les séquences ont été lues sur un séquenceur ABI 3100 Applied Biosystems Les séquences résultantes ont été analysées et comparées avec la séquence M genitalium G37 en utilisant le logiciel BioNumerics, version 4 Applied MathsDéveloppement d’une PCR pour la détection de mutations dans le gène 23S rRNA conférant des amorces de résistance aux macrolides ciblant des régions uniques du gène ARNm 23S M genitalium. les mutations trouvées dans la région V du gène de l’ARNr 23S ont été conçues après alignement avec des séquences de Mycoplasma pneumoniae, Ureaplasma urealyticum et d’autres espèces étroitement apparentées pour produire un amplicon de 147 paires de bases Les amorces Mg23S-1992F 5’-CCATCTCTTGACTGTCTCGGCTAT-3 ‘et Mg23S -2138R 5’-CCTACCTATTCTCTATGGTGGTGTT-3 ‘ont été utilisés dans une PCR conventionnelle avec un volume réactionnel final de 100 ul contenant 1 x tampon PCR PlatinumTaq; Invitrogen constitué de 20 mmol / L de tris-chlorhydrate avec un pH de 84 et 50 mmol / L de chlorure de potassium, avec 15 mmol / L de chlorure de magnésium; 04 mmol / L de chaque amorce; 125 umol / L chacun de dATP, dGTP et dCTP et 250 umol / L de dUTP; Après activation de l’enzyme à 95 ° C pendant 2 min, 40 cycles constitués chacun d’une dénaturation de 15 s à 95 ° C et d’une étape d’hybridation et d’allongement combinés de 60 s à 60 ° C et 2 U de platine Taq ADN polymérase Invitrogen Les échantillons positifs ont été séquencés dans les deux sens avec les mêmes amorces que celles utilisées pour l’amplification. Pour évaluer la spécificité du test de détection de mutations, un panel de 100 échantillons urogénitaux choisis au hasard parmi des échantillons soumis à un test PCR systématique de C trachomatis a été soumis à la PCR de détection de mutation Tous ont été trouvés négatifs pour M genitalium par TaqMan PCR [18] Des échantillons de voies respiratoires ont été obtenus chez 10 patients avec une infection à M pneumoniae comme documenté par PCR [19], ainsi qu’une préparation purifiée d’ADN de M pneumoniae contenant 1 × 104 copies d’ADN, ont également été testés dans le test de détection de mutation. L’ADN purifié M genitalium G37 a été utilisé comme matrice dans le test de détection de mutation et a été dilué à & lt; 1 0 copies du génome pour démontrer la limite de détection de l’essaiGénotypage deM genitalium dans les spécimens de prétraitement et de posttraitementM genitalium dans les échantillons de prétraitement et de posttraitement des 9 patients australiens et de 2 des patients scandinaves, ainsi que des souches isolées dans le système de culture cellulaire Vero, ont été génotypés en utilisant le système de typage M genitalium MgPa 1-3, comme décrit ailleurs [11]. En bref, les échantillons ont été amplifiés puis séquencés en utilisant l’ensemble d’amorces MgPa-1 et MgPa-3 décrit ailleurs [15] ensembles d’échantillons, l’échantillon de post-traitement ne s’est pas amplifié; par conséquent, seule la séquence de l’échantillon de prétraitement était disponible

Résultats

Isolement du genitalium chez les hommes ayant subi un échec du traitement par l’azithromycineM génitalium a été propagé dans le système de culture cellulaire Vero à partir de tous les 7 spécimens pour lesquels la culture a été tentée Cinq des souches ont ensuite été adaptées pour croître dans le milieu mycoplasma modifié de Friis; 4 ont été clonés en une seule colonie pendant 3 tours pour assurer l’homogénéité des souches, et la souche restante est, à ce jour, encore en cours de clonage d’une seule colonie. Deux souches semblent incapables de croître en milieu axénique. le système de culture cellulaire pour toutes les 7 souches, et toutes les souches étaient hautement résistantes aux macrolides à la fois des macrolides à 14 et 15 membres; La CMI de l’azithromycine était> 8 μg / mL Les CMI individuels pour toutes les souches sont présentés dans le tableau 2Analyse des gènes médiant la résistance aux macrolides dans les souches génitaliennes 14M Des mutations ponctuelles ont été trouvées dans les gènes L4 et L22, respectivement, mais la plupart n’ont pas Changements d’acides aminés Dans L4, une substitution d’acides aminés H69R a été trouvée dans la souche M6303. Il s’agit du seul changement d’acides aminés dans les régions précédemment impliquées dans la résistance aux macrolides chez les mollicutes [20] a été trouvé dans L4, et dans la souche résistante aux macrolides M 6270, une substitution E123K a été trouvée dans L22 tableau 2. Ces 2 mutations, cependant, n’ont pas été précédemment associées à la résistance aux médicaments. Aucune mutation n’a été détectée dans la région II du gène ARNr 23S, mais 3 mutations différentes ont été détectées dans la région V Une numérotation d’Escherichia coli de transition A2058G a été trouvée dans 3 des souches résistantes, alors qu’une transition A2059G dans la position adjacente a été détectée 3 mutations Une souche a eu une transversion A2058C Toutes les 3 mutations ont conduit à une résistance élevée des macrolides aux macrolides à 14 et 15 membres du tableau 2PCR pour la détection de mutations dans le gène 23S de l’ARNr qui confèrent la résistance aux macrolides. de la PCR détectant les mutations dans les positions 2058 et 2059 E coli numérotation du gène ARNr 23S, un panel de 100 échantillons urogénitaux qui ont été choisis au hasard parmi les échantillons soumis pour le test C trachomatis de routine a été soumis à la PCR Tous les échantillons avaient été précédemment trouvé négatif pour M genitalium par TaqMan PCR [18], et aucun des échantillons n’a réagi dans le test de détection des mutations. Les échantillons respiratoires obtenus chez 10 patients avec une infection à M pneumoniae documentée par PCR ont également eu des résultats négatifs dans la PCR de détection de mutation, comme fait une préparation d’ADN purifié de M pneumoniae qui contenait 1 × 104 copies d’ADN par réaction de PCR avec l’utilisation de M genitalium purifié G37 ADN comme temp tard, le test de détection de mutation a produit des résultats clairs, même avec une entrée de copies du génome de 10, démontrant son applicabilité pour détecter les mutations directement dans des échantillons cliniques. Le test a été appliqué à des échantillons de prétraitement et de posttraitement et 2 patients qui ont été inclus en Scandinavie Cependant, des ensembles complets de séquences ont été obtenus de seulement 9 patients, parce que 2 des échantillons de posttraitement des patients australiens n’ont pas amplifié étonnamment, seulement 2 patients avaient des souches avec une mutation A2058G ou A2059G dans les échantillons de prétraitement, suggérant que, chez la majorité des patients, le mutant pharmacorésistant a été sélectionné pendant le traitement Le fait que le type MgPa 1-3 des souches de M genitalium qui étaient présentes dans les échantillons de prétraitement et de post-traitement était identique suggère fortement que les patients n’étaient pas co-infectés par des souches de sélection ultérieure du type résistant aux médicaments

Discussion

l’échec avait acquis leur infection en Asie du Sud-Est, contre 27% de ceux ayant une réponse favorable à l’azithromycine Cependant, la découverte que seulement 1 des 9 échantillons de prétraitement australiens inclus dans cette étude portait une souche avec la mutation de résistance aux macrolides dans l’ARNr 23S gène La question de l’importance de cette découverte Rien n’indique que les souches résistantes aux macrolides ont un taux de croissance plus lent in vitro ou in vivo. La propagation rapide des souches de M pneumoniae résistantes aux macrolides suggère également que l’aptitude des souches mutées n’est pas 8 patients australiens sur 9 lors du traitement par l’azithromycine ont présenté un soulagement subjectif temporaire, alors qu’un patient était asymptomatique de façon persistante. Le patient 1 chez lequel une souche présentant une mutation résistante a été détectée dans le prétraitement a également rapporté une amélioration au cours du traitement par azithromycine. peut être attribuable à la propriété immunomodulatrice d’angiomycine [25] et soulève des questions intéressantes quant à la possibilité de traiter la NGU pathogène-négative récurrente avec des anti-inflammatoires non stéroïdiens. En effet, dans une étude antérieure impliquant des hommes atteints de NGU aiguë, il a été montré que les récurrences étaient moins une combinaison de kétoprofène et doxycycline [26] Ces résultats, cependant, doivent être confirmés dans des études plus larges et bien contrôlées. L’utilisation du système de culture cellulaire Vero pour la propagation initiale des souches M genitalium à partir des échantillons cliniques et la détermination directe subséquente des CMI dans la culture cellulaire [6] a clairement démontré le potentiel de cette méthode pour d’autres études des points de rupture cliniquement pertinents pour divers antibiotiques. Toutes les 7 souches étaient capables de se multiplier dans le système de culture cellulaire Bien que certains spécimens contenaient un très faible nombre de copies d’ADN, comme déterminé par le dosage PCR TaqMan quantitatif, les organismes ont augmenté relativement facilement, et déterminent MIC En général, cela peut sembler très lent, mais il reste une réduction significative du temps nécessaire pour obtenir des résultats, par rapport au temps nécessaire pour l’adaptation des mycoplasmes à la croissance axénique. culture En outre, l’utilisation du système de culture de cellules Vero est encore plus importante, car certaines des souches ne peuvent pas être adaptées à la croissance axénique, même après des tentatives répétées pendant 1 an. Il est évident, cependant, que les méthodes basées sur la culture sont Le développement du test de détection des mutations représente une amélioration majeure Bien que le séquençage du fragment V de la région amplifiée ait été simple, il pourrait être possible de simplifier davantage le dosage en appliquant une simple digestion par des enzymes de restriction. , comme décrit ailleurs pour M pneumoniae [27] Le test de détection de mutation n’a montré aucune réaction croisée avec M pneumoniae lorsque l’ADN purifié a été utilisé dans un conc Cependant, si de très grandes quantités d’ADN de M pneumoniae étaient présentes, de légères réactions croisées ne pourraient être exclues. M pneumoniae a été détecté dans le tractus urogénital. Aucun des échantillons cliniques provenant de patients atteints d’infection à M pneumoniae n’a réagi. [28, 29], il n’est pas communément trouvé sur ce site [30], et les amplicons de M pneumoniae pourraient éventuellement être distingués des amplicons de M genitalium par une différence d’un seul nucléotide dans la séquence amplifiée. Les échantillons génito-urogénitaux négatifs réagissent négativement au test de détection des mutations et confirment les résultats des échantillons positifs au M genitalium. Dans la présente étude, nous avons montré que la résistance aux macrolides survient chez une faible proportion de patients initialement traités par l’azithromycine. test de détection de mutation que nous avons développé pourrait être un outil précieux pour diriger un traitement approprié de ces patients Les traitements de seconde intention du M genitalium n’ont pas fait l’objet d’études approfondies et bien que la moxifloxacine semble éradiquer l’infection chez les patients présentant un échec de l’azithromycine, elle est coûteuse et le risque de développer une résistance aux quinolones est considérable. de la présente étude indiquent qu’il ne serait pas possible de prédire l’échec du traitement par l’azithromycine chez tous les patients lors de la première présentation, et le test de détection de la mutation pourrait être mieux utilisé chez les patients présentant un échec du traitement par macrolide. Ces résultats ont une application directe à la pratique clinique et mettent en évidence la nécessité de poursuivre les études pour déterminer les traitements optimaux de première intention et de seconde ligne pour les NGU en général et pour les infections à M genitalium dans de nombreux pays. M infection génitale chez les hommes et les femmes en parti cular

Remerciements

Nous remercions Gunnel Bojs, Hans Carlberg et Harald Moi, qui ont fourni des spécimens et des antécédents cliniques de patients scandinaves; Gitte Christiansen, Berit Larsen, Line Hein-Knudsen et Birthe Dohn, qui ont fourni une assistance technique en matière de culture, de PCR et de séquençage; Carol Hopkins, Lorna Moss et Tim Read, qui ont aidé à mener l’étude sur l’urétrite non gonococcique dans laquelle les échantillons de Melbourne ont été prélevés; et Suzanne Garland, qui a fourni un soutien de laboratoire pour l’étude originale sur l’urétrite non gonococcique. Fondamental, Aage Bangs Fond, l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses, et U19 AI061972 à JSJ, et une bourse de recherche du Conseil national de recherches médicales et de recherche 465164 au CSB