Identification des inhibiteurs de la petite molécule Purine-Scaffold de Stat3 Activation par les études QSAR

La famille des protéines transducteurs et activateurs de la transcription (STAT) sont des facteurs de transcription cytoplasmiques jouant un rôle important dans la médiation des réponses cellulaires, notamment la croissance et la différenciation cellulaire, l’inflammation et les réponses immunitaires1. stimulation du récepteur par des cytokines, des facteurs de croissance et d’autres ligands polypeptidiques. Cependant, l’activation constitutive du membre Stat3 de la famille est très répandue dans les tumeurs humaines.2,3 Des preuves convaincantes démontrent que stat3 aberrantly active induit une transformation maligne et une tumorigenèse, 3 en servant de régulateur principal des événements moléculaires favorisant la tumeur dans les cellules. Stat3 est donc devenu une cible valable pour la conception de médicaments anticancéreux. Actuellement, il existe plusieurs efforts pour découvrir et développer de nouveaux inhibiteurs de Stat3 pour l’application thérapeutique et pour explorer les processus moléculaires et tumoraux médiés par Stat3. Les interactions protéiques sont un événement moléculaire critique dans l’induction des voies de transduction du signal. Pendant l’activation, les protéines STAT sont recrutées via le domaine d’homologie Src (SH) 2 aux motifs peptidiques du récepteur apparenté phosphotyrosine (pTyr). La liaison aux récepteurs liés à la membrane représente une étape clé initiale pour la phosphorylation et l’activation de STAT, amenant les protéines à proximité des tyrosine kinases pour la phosphorylation du résidu tyrosine critique (Y705 pour Stat3) .1,3,4 Les monomères STAT tyrosine phosphorylés s’engager dans la dimérisation par une interaction réciproque du domaine pTyr-SH2, créant des dimères STAT: STAT transcriptionnellement actifs qui régulent l’expression des gènes dans le noyau en se liant à des éléments spécifiques de la réponse ADN dans les promoteurs des gènes cibles1. l’interaction initiale du domaine pTyr-SH2 est l’un des sites de ciblage dans de nombreux programmes de découverte de médicaments pour identifier les inhibiteurs de Stat3 en tant que nouveaux agents anticancéreux. De nombreux inhibiteurs de la petite molécule Stat3 ont été rapportés, dans certains cas avec des activités cellulaires et des preuves d’efficacité in vivo.5 − 18 Alors que les études utilisant des inhibiteurs de petites molécules et des modulateurs génétiques4,19 fournissent la preuve de concept pour l’application thérapeutique potentielle des médicaments inhibiteurs de Stat3, aucun agent inhibiteur de Stat3 à petite molécule n’a jusqu’à présent avancé à la clinique.Afin d’accélérer l’identification des inhibiteurs Stat3 cliniquement utiles, les petites molécules disloquantes de dimérisation Stat3 ont été soumises à une analyse computationnelle (GEL) pour dériver un modèle de pharmacophore à relation de structure quantitative quantitative (QSAR) pour prédire des inhibiteurs de Stat3 optimisés. . La structure cristalline du complexe ternaire Stat3: Stat3-ADN20 a révélé la composition structurelle et la topologie de la liaison au domaine SH2, identifiant trois sous-poches sur la surface de la protéine du domaine SH2 qui sont accessibles au solvant, étiquetées A, B et C (figure ​ (figure 1A) .1A). L’analyse GOLD21 de tous les inhibiteurs de Stat3 connus dans le domaine Stat3 SH2 a donné des configurations de liaison homologues (Figure 1B), les inhibiteurs occupant systématiquement au moins deux des trois sous-poches principales (Figure 1B). ) .1B). Plus particulièrement, tous les composés ont interagi avec le sous-pilier A, qui héberge le groupe clé pTyr705, et est largement composé des résidus polaires Lys591, Ser611, Ser613 et Arg609,22 et se sont révélés être en contact avec ces résidus via un donneur de liaison hydrogène (HBD) ou Groupes d’accepteurs de liaisons hydrogène (HBA). Figure 1: Études de l’ancrage et de la relation quantitative structure-activité, et modélisation pharmacophore de la liaison de Stat3 aux inhibiteurs de dimérisation de petites molécules. (A) sites de liaison de domaine Stat3 SH2 et résidus d’acides aminés clés, (B) inhibiteurs de Stat3 GOLD-docked … En développant notre modèle pharmacophore à partir de composés actifs connus, nous avons considéré seulement les groupes fonctionnels pertinents pour une interaction efficace centres. Nous avons préparé un diagramme simple de pharmacophore identifiant le positionnement optimal de la fonctionnalité cruciale pour la liaison au domaine Stat3-SH2 (Figure ​ (Figure 1C) .1C). L’unité centroïde, représentée par une sphère bleue, représente le positionnement potentiel du cœur d’échafaudage à partir duquel la fonctionnalité peut être ajoutée de façon optimale pour accéder à A, B et C. Nous avons ensuite considéré le pharmacophore 3D, où nous spécifierions les positions relatives du groupes dans l’espace. Notre modèle de pharmacophore décrit un échafaudage essentiellement planaire, hétéro-trisubstitué décoré avec des éléments de reconnaissance optimale et confiné dans le tracé de pharmacophore spécifié (Figure ​ (Figure 1C) .1C). Les études d’amarrage computationnelles ont identifié des échafaudages de purine 2,6,9-trisubstitués comme un choix prometteur de squelette structurel pour projeter la fonctionnalité dans les trois sommets de la parcelle de pharmacophore (Figure 1D1D et ​ et11E) .Forty-sept des inhibiteurs puriques 2,6,9-trisubstitués dirigés par un pharmacophore ont été synthétisés (Tableau 1), comme indiqué précédemment23,24 et évalués par analyse de résonance plasmonique de surface (SPR) 16 pour leurs interactions (en tant qu’analyte) avec Stat3 (cible). le troisième a montré une haute affinité de liaison à Stat3 (KD < 10 μ M), y compris S3I-V3-32, S3I-V4-01, S3I-V3-31, S3I-S2-36, S3I-S2- 30, S3I-V2-66 et S3I-S2-38 (Tableau 1, SPR) Les détails de l'étude QSAR et la discussion de la DAS sont présentés dans les Informations à l'appui.Tableau 1Structures et Activités de Purine Scaffold MoleculesaNotre étude montre que 2 , Échafauds purines 6,9-trisubstitué interagissent avec Stat3, vraisemblablement sur les trois sous-poches sur la surface du domaine Stat3 SH2 (Figu res ​ (Figures 1A1A et ​ et 1D) .1D). L'interaction avec Stat3 devrait perturber la liaison de Stat3 à son peptide apparenté pTyr et, par conséquent, Stat3: Stat3 dimérisation.6 − 8,16 Évaluation supplémentaire des molécules de purine-échafaudage in vitro Stat3 DNA-binding assay / électrophorétique mobilité shift dosage (EMSA), comme indiqué précédemment, 16 ont démontré que les agents de sélection, S3I-V3-29, S3I-V3-30, S3I-V3-31, S3I-V3-32, S3I-V3-34, S3I-V4- 01, et S3I-S2-21, qui a montré une bonne affinité de liaison pour Stat3 (Tableau 1, SPR), a également fortement inhibé l'activité Stat3, avec des valeurs IC50 de 27 − 84 μ M (Tableau 1, EMSA). Les données de l'analyse EMSA n'ont pas toujours montré une bonne corrélation avec l'analyse SPR. Nous notons que bien que les disrupteurs de dimérisation Stat3 puissent montrer une activité élevée dans l'inhibition de la dimérisation, les activités dans l'analyse de liaison à l'ADN / analyse EMSA ont généralement été plus faibles16. Les raisons de cette différence sont la présence d'un grand nombre de protéines. cibles ” dans les préparations d'extrait nucléaire utilisées dans l'analyse de liaison à l'ADN et le potentiel de perturbation des dimères Stat3: Stat3 préformés, comme dans l'essai de liaison à l'ADN est une tâche plus difficile, comme cela a été précédemment suggéré.5,6 L'analyse par immunoblotting a montré une inhibition modérée à forte par S3I-V3-31, S3I-V3-32, S3I-V3-34 et S3I-V4-01 de la phosphorylation Stat3 constitutive dans les fibroblastes de souris transformées par v-Src (NIH3T3 / v-Src) et la lignée du cancer du sein humain, MDA-MB-231, qui abritent l'activité Stat3 aberrante3,4 après des traitements de 12, 24 ou 48 h (Figure 2A (i) 2A (i) et Figure 2A (ii), 2A (ii), pY705, pistes 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12, 15 et 18, comparées aux pistes 1, 4, 7, 10, 13 et 16, et données non montrées) En revanche, les mêmes traitements n'ont aucun effet sur les niveaux constitutifs de phospho-ErkMAPK (pErk1 / 2) ou Src (pSrc) (figure ​ (figure 2A) .2A). Cependant, l'inhibition de la phosphorylation de Stat3 a montré une cinétique différente entre les purines étudiées, ce qui a permis d'étudier plus en détail les effets des inhibiteurs dans les fibroblastes NIH3T3 / v-Src, le traitement par S3I-V3. -31 ou S3I-V3-32 a inhibé de façon constante l'activité Stat3 dès 15 − 60 min (figure ​ (figure2A (iii), 2A (iii), deux panneaux de droite). Les données montrent également que la phosphorylation de Stat3, qui a été inhibée tôt, a semblé être temporairement restaurée pendant un traitement prolongé (Figure 2A (iii), 2A (iii), NIH3T3 / v-Src). Ligne MB-231, la phosphorylation de Stat3 était systématiquement inhibée par S3I-V3-31 dès 30 minutes après le traitement, avec des signes de restauration pendant le traitement pendant 6 h (Figure 2A (iii), 2A). (iii), à gauche, en haut des deux panneaux), tandis que l'inhibition de l'activation de Stat3 par S3I était 32 forte à 6 heures après le traitement (figure 2A (iii), 2A (iii), Si les données suggèrent une cinétique différente d'inhibition de la phosphorylation constitutive intracellulaire de Stat3 par les matrices purines, les données montrent que, après 48 h de traitement, la phosphorylation de Stat3 reste faible. Figure 2 Immunoprécipitation et analyse immunoblotting pour les effets des agents sur Activation intracellulaire de Stat3, ErkMAPK, Src et Stat1. sis de lysats de cellules entières de protéines totales égales préparées à partir de cellules NIH3T3 / v-Src et MDA-MB-231 ... En outre, des études avec S3I-V3-34 et S3I-V4-01 pour les effets sur l'activation de STAT stimulée par ligand ont montré une inhibition sélective de la phosphorylation de Stat3 induite par le facteur de croissance épidermique (EGF) dans des fibroblastes de souris surexprimant le récepteur de l'EGF humain (NIH3T3 / hEGFR), évaluée par immunoblot des lysats de cellules entières (Figure 2B (i)). , 2B (i), pY705Stat3, pistes 3 et 4, comparé à la piste 2). Le bloc de phosphorylation Stat3 induite par ligand suggère que les agents purines pourraient interagir avec les monomères Stat3 inactifs, vraisemblablement le domaine SH2, et donc occlure Stat3 se liant au récepteur EGFR et, par conséquent, bloquer de novo Stat3 phosphorylation, ainsi que bloquer Stat3: Par contraste, il n'y avait aucun effet sur la phosphorylation de Erk (pErk1 / 2) et Src (pSrc) dans la même étude (Figure 1). ​ (Figure2B (i)) .2B (i)). Fait important, des traitements similaires n'ont montré aucun effet significatif sur la phosphorylation induite par EGF du membre de la famille STAT, Stat1, tel qu'évalué par l'analyse par immunoblotting (Figure 2B (i), 2B (i), pStatl) et par Stat1. précipitation de complexe immun, avec l'analyse d'immunoblotting de pTyr générale (figure 2B (ii)) 2B (ii)) Ainsi, bien que les échafaudages de purine aient été typiquement employés pour viser la poche d'ATP des kinases aberrantes, nous spéculons que le La taille des appendices et l'absence de HBA avec les agents de la présente étude empêcheront l'accès à la majorité des sites actifs confinés, tout en conférant une haute sélectivité pour le domaine Stat3 SH2 L'activité aberrante Stat3 favorise la croissance et la survie des cellules cancéreuses et la tumeur angiogenèse et métastase.3 − 8,12,25 Le test de prolifération cellulaire CyQuant montre les lignées prostatiques humaines (DU145), mammaires (MDA-MB-231) et pancréatiques (Panc-1) et transformées en v-Src fibroblastes de souris (NIH3T3 / v-Src) qui hébergent const Les statines statutivement actives sont sensibles à la sélection de petites molécules de type purine-échafaudage, notamment S3I-V3-30, S3I-V3-31, S3I-V3-32, S3I-V3-34 et S3I-V4-01 qui diminuent la viabilité des cellules malignes (Figure ​ (Figure 3), 3), avec des valeurs IC50 de 41 − 80 μ M concentrations (Tableau 2). La viabilité des fibroblastes normaux de souris (NIH3T3) et des cellules stromales épithéliales du thymus murin (TE-71) qui n'abritent pas l'activité Stat3 aberrante, 16 cependant, n'est pas affectée par les agents, avec des valeurs IC50 supérieures à 500 μ M ( Figure ​ (Figure 33 et Tableau 2) Ainsi, certaines petites molécules d'échafaudage purine inhibent sélectivement l'activation de Stat3 dans les cellules malignes, et induisent la perte de viabilité des cellules tumorales qui hébergent Stat3 active de façon persistante.Au total, les données présentées indiquent que certains composés de purine, y compris S3I-V3-31, S3I-V3-32, S3I-V3-34 et S3I-V4-01, ont un effet sur l'activité Stat3 et induisent une perte de viabilité des cellules malignes qui Port constitutivement actif Stat3. Bien que l'activité de Stat3 semble être temporairement restaurée après l'inhibition, l'inhibition initiale précoce de l'activité aberrante de Stat3 est suffisante pour promouvoir la perte de viabilité des cellules malignes hébergeant Stat3.Figure 3 Les échafauds de Périne suppriment sélectivement la viabilité des cellules malignes qui hébergent Stat3 active de façon persistante. Cellules cancéreuses du sein humain (MDA-MB-231), du pancréas (Panc-1) et de la prostate (DU145), les fibroblastes transformés (NIH3T3 / v-Src) v-Src ou leur ... Tableau 2Cell Viability AssayHerein est présenté l'application de QSAR pour étudier la liaison des inhibiteurs de dimérisation de Stat3 au domaine Stat3 SH2 et l'identification par pharmacophore QSAR modélisation des échafaudages de purine comme une nouvelle classe d'inhibiteurs de Stat3, et qui sont les premiers de leur genre. De nouvelles molécules de petite purine-échafaudage se lient à Stat3, probablement le domaine SH2, et inhibent sélectivement l'activation de Stat3 in vitro, supprimant ainsi la viabilité des cellules tumorales qui dépendent de la signalisation oncogénique Stat3. Bien que les inhibiteurs de purine-échafaudage actuels s'ajoutent à la liste des inhibiteurs de dimérisation de Stat3, 9,11,12,14,17,18,26,27 ils sont plus attrayants, étant donné l'application clinique existante des analogues de nucléosides.28,29 Le présent échafaudage purine fournit une plate-forme appropriée pour développer des inhibiteurs de Stat3 optimisés et cliniquement viables.