Détermination de l’effet à long terme de l’administration d’antibiotiques sur le microbiote intestinal humain normal en utilisant des méthodes de culture et de pyroséquençage

Le but de l’étude était d’évaluer l’effet de la ciprofloxacine mg deux fois par jour pendant plusieurs jours ou de la clindamycine mg fois par jour pendant plusieurs jours sur le microbiote fécal d’humains en bonne santé comparativement à un placebo. Les intervalles fécaux nécessaires pour normaliser le microbiote normal après diffé- rence entre la ciprofloxacine et la clindamycine différaient selon les espèces bactériennes. Il a fallu plusieurs mois pour normaliser le microbiote humain après l’administration d’antibiotiques, l’effet le plus L’exposition à la ciprofloxacine ou à la clindamycine a eu un effet important sur la diversité du microbiome et des changements dans la composition microbienne ont été observés jusqu’au mois, avec le déplacement microbien le plus prononcé au mois. Aucune infection au C. difficile ou C Clostridium difficile n’a été signalée. résultats de pyroséquençage, il semble que la clindamycine ait plus d’impact n ciprofloxacine sur le microbiote intestinal

antibiotiques, microbiote intestinal, culture, pyroséquençage La surface muqueuse du tractus gastro-intestinal humain est colonisée par différents microorganismes, collectivement appelés le microbiote normal du tractus gastro-intestinal Le rôle de ces microorganismes sur la santé humaine et la maladie est très complexe. L’impact du microbiote sur la physiologie, l’immunité et la nutrition n’est pas bien compris Le microbiote normal du tractus gastro-intestinal diffère qualitativement et quantitativement de l’humain à l’humain Certains composants de ce microbiote sont toujours présents en grand nombre humains, et agissent comme une barrière contre la colonisation par des micro-organismes potentiellement pathogènes Des études du microbiote humain, avec des méthodes moléculaires et culturales améliorées pour quantifier le microbiote et étudier sa fonction, ont fourni plus de connaissances [, -] Perturbations dans la microbiote peut survenir en raison de changements dans l’alimentation, les radiations ou les L’apparition d’agents antimicrobiens peut avoir plusieurs effets néfastes sur le microbiote L’émergence de résistance chez les bactéries dans le microbiote normal et la distribution des gènes de résistance par transfert intraspécifique et interespèces de l’ADN dans la communauté microbienne peuvent contribuer Un autre effet d’un microbiote normal perturbé dû à l’administration d’agents antimicrobiens est une réduction de la résistance à la colonisation, entraînant une prolifération de microorganismes déjà présents ou de pathogènes exogènes La ciprofloxacine est un antibiotique de la famille des fluoroquinolones de deuxième génération, avec un large spectre d’activité ciblant à la fois les bactéries et les micro-organismes. bactéries négatives et gram-positives Niveaux élevés de ciprofloxacine La clindamycine est un antibiotique lincosamide à large spectre antimicrobien comprenant des bactéries aérobies à Gram positif et des bactéries anaérobies La clindamycine est bien absorbée mais elle est excrétée principalement par la bile, et par conséquent les concentrations fécales atteignent des niveaux élevés. Les effets de la ciprofloxacine et de la clindamycine sur la salive humaine et le microbiote intestinal ont été étudiés auparavant, mais aucune étude clinique n’a examiné les effets à long terme de la ciprofloxacine ou de la clindamycine sur le microbiote intestinal par rapport au placebo. Nous avons évalué l’effet de la ciprofloxacine et clindamycine, comparé au placebo, sur le microbiote intestinal par des méthodes classiques basées sur la culture et moléculaires chez des humains en bonne santé pendant une période de l’année

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Les objectifs de cette étude étaient d’évaluer l’effet de l’administration de ciprofloxacine et de l’administration de clindamycine sur la composition du microbiote dans les fèces

Étudier le design

Trente volontaires sains âgés de 0 à 1 an avec des résultats normaux dans leurs antécédents médicaux et des examens physiques hommes et femmes ont été inclus dans l’étude. Les volontaires avaient subi une période de lavage d’au moins un mois après un traitement avec des antibiotiques systémiques ou topiques. Vingt volontaires ont été randomisés dans les groupes de traitement ciprofloxacine ou clindamycine et des volontaires dans le groupe témoin. Dix volontaires hommes et femmes ont été inclus dans une autre étude expérimentale sur un médicament expérimental ou un dispositif ayant participé à une telle étude. mg de ciprofloxacine deux fois par jour et des volontaires hommes et femmes ont reçu de la clindamycine mg fois par jour pendant une journée; les volontaires restants, hommes et femmes, du groupe témoin ont reçu un placebo pendant plusieurs jours. Des échantillons fécaux ont été prélevés pour des analyses occasionnelles: immédiatement avant l’administration d’un antibiotique ou d’un placebo, soit immédiatement après le traitement, et, et mois après

Approbations éthiques

Le protocole d’étude soumis au Comité d’Ethique de l’Institut Karolinska de Stockholm en Suède et à l’Agence des Produits Médicaux d’Uppsala en Suède a été approuvé avant de commencer l’essai.

Échantillonnage fécal

Les échantillons fécaux ont été recueillis par les sujets avant l’administration du médicament ou du placebo, le jour, et après des mois, et après le traitement. Les échantillons fécaux ont été recueillis dans des récipients en plastique stériles et conservés à ° C jusqu’à leur transport au laboratoire de microbiologie. ils ont été congelés à – ° C jusqu’à analyse

Détermination des concentrations de Ciprofloxacine et de Clindamycine dans les matières fécales

Les concentrations de ciprofloxacine et de clindamycine dans les échantillons de fèces aux différents moments ont été analysées microbiologiquement en utilisant la méthode de diffusion sur puits agar avec Escherichia coli ATCC et Micrococcus luteus ATCC comme souches indicatrices, respectivement

Traitement des échantillons pour analyses microbiologiques

Cultivation

Les échantillons fécaux ont été dilués et inoculés sur des géloses non sélectives et sélectives comme décrit par Nord et al avec une modification mineure. Tous les isolats ont été analysés par coloration de Gram et morphologie des colonies, suivis de tests biochimiques Pour certains anaérobies, chromatographie en phase gazeuse et la désorption laser / ionisation-temps de vol assistée par matrice ont été utilisées

Extraction d’ADN, préparation d’amplicon, pyroséquençage et analyse de données

L’ADN a été extrait comme décrit précédemment Des banques d’amplicon à codes-barres de la région hypervariable V-V du petit sous-unité ARN ribosomique ont été générées pour chacun des échantillons individuels, regroupées et séquencées en utilisant le système Genome Sequencer FLX Titanium Roche, Bâle, Suisse. Les données de séquençage ont été traitées à l’aide de QIIME Quantitative Insights dans Microbial Ecology comme décrit précédemment Le tableau de données avec les unités taxonomiques opérationnelles OTUs a été sous-échantillonné au plus petit nombre de lectures / échantillons pour permettre des comparaisons entre différents échantillons. a été utilisé avec un logiciel PAST Un test t apparié implémenté dans QIIME a été utilisé pour identifier les OTU représentées différemment parmi les différents points temporels. Le test de signification OTU a été utilisé pour comparer le groupe traité et le groupe placebo. correction de taux pour le nombre de comparaisons Les OTU présents dans au moins Dans les analyses, les différences d’abondance relative des genres principaux présents en moyenne dans au moins% des lectures parmi les groupes de traitement ont été comparées en utilisant le test de Kruskal-Wallis dans SPSS SPSS, version Seulement les genres significatifs du Kruskal-Wallis test a été testé avec Mann-Whitney test pour évaluer les différences entre les traitements Correction de Bonferroni a été utilisé pour corriger la probabilité de comparaisons multiples Test de mesures répétées du modèle linéaire général pour les échantillons connexes et analyse de variance -way avec test post hoc Games-Howell pour non apparenté échantillons ont été utilisés pour analyser le nombre de taxons UTO et indice de dominance Nombre de taxons, également appelé richesse spécifique, montre le nombre de taxons microbiens ou UTO dans chaque échantillon Indice de dominance mesure la distribution des taxons dans l’échantillon: Si tous les taxons sont également présents , cet indice est nul, alors qu’il en est un si le taxon domine complètement la communauté

RÉSULTATS

Bénévoles

Dans le groupe placebo, tous les volontaires ont terminé l’étude. Dans le groupe ciprofloxacine, une patiente volontaire a été exclue plusieurs mois après l’administration en raison d’une infection nécessitant un traitement antibiotique. Les échantillons de ce volontaire n’ont pas été analysés avec des méthodes de culture; cependant, les échantillons recueillis jusqu’à la visite de suivi de mois ont été étudiés par les analyses de microbiome et sont inclus. Dans le groupe clindamycine, la femelle volontaire a arrêté l’étude directement après le traitement pour des raisons personnelles L’âge médian des volontaires dans la ciprofloxacine, clindamycine, et les groupes placebo étaient, et des années, respectivement

Concentrations de Ciprofloxacine dans les matières fécales

Neuf volontaires hommes et femmes du groupe traité par la ciprofloxacine ont terminé l’étude. Les concentrations de ciprofloxacine ont été déterminées dans les fèces à chaque moment de prélèvement des échantillons. La ciprofloxacine a été détectée dans les fèces uniquement sur une plage de jours, – mg / kg de fèces traitées par ciprofloxacine volontaires Aucune concentration mesurable de ciprofloxacine dans les fèces n’a été détectée chez les volontaires du groupe placebo.

Concentrations de clindamycine dans les matières fécales

Neuf volontaires hommes et femmes ont terminé l’étude Les concentrations de clindamycine ont été déterminées dans les fèces à chaque moment de la collecte des échantillons. La clindamycine a été détectée dans les fèces uniquement pendant la journée, – mg / kg de fèces chez les volontaires traités par la clindamycine. dans les fèces a été détecté chez un volontaire du groupe placebo

Composition quantitative du microbiote intestinal dans le groupe placebo

Les résultats des cultures quantitatives de micro-organismes aérobies et anaérobies intestinaux sont présentés sur la figure. Il n’y a eu aucun changement dans le microbiote intestinal dans le groupe placebo au cours de la période

Figure Vue largeDownload slideA-D, Effet sur les bactéries cultivables dans les fèces de volontaires recevant de la clindamycine ○ mg fois par jour ou de la ciprofloxacine Δ mg deux fois par jour pendant des jours comparés aux volontaires recevant un placebo □ Les symboles pleins correspondants représentent les valeurs médianes le groupe placebo, la ligne pointillée représente la médiane dans le groupe ciprofloxacine et la ligne pointillée représente la médiane dans le groupe clindamycine. Le niveau le plus bas de détection est constitué d’unités formant des colonies par gramme de fècesFigure View largeTélécharger slideA-D, Effet sur les bactéries cultivables dans les fèces de volontaires recevant de la clindamycine ○ mg fois par jour ou de la ciprofloxacine Δmg deux fois par jour pendant des jours comparés aux volontaires recevant un placebo □ Les symboles pleins correspondants représentent les valeurs médianes La ligne pleine montre la médiane dans le groupe placebo, la ligne pointillée représente la médiane le groupe ciprofloxacine, et la ligne pointillée représente la médiane en t Le groupe de la clindamycine Le plus faible niveau de détection est constitué des unités formant des colonies par gramme de matières fécales.

Résultats globaux de séquençage

Au total, un million de lectures de séquençage ont réussi les étapes de filtrage de qualité, avec une lecture moyenne par écart type d’échantillon,; range, – reads Les séquences ont été regroupées en OTU à% similarity Pour permettre des comparaisons entre échantillons, l’ensemble de données a été sous-échantillonné aléatoirement à des lectures par échantillon Ce jeu de données final incluait les OTU La majorité des lectures% étaient classées en phyla: Firmicutes% des lectures et Bacteroidetes% des lectures La plupart des lectures restantes ont été classifiées dans le phyla Proteobacteria%, Tenericutes%, Actinobacteria%, et Verrucomicrobia% De toutes les lectures,% ne pourrait pas être classifié plus loin aux bactéries de domaine, tandis que% des lectures ont représenté pour les phylums mineurs tels que Cyanobacteria%, Lentisphaerae%, Synergistetes%, Fusobacteria%, et divisions candidates Rf%, et TM% Au niveau taxonomique le plus élevé, les lectures ont été classées en genres ou en taxons supérieurs.

Profils de microbiome fécaux dans le groupe placebo

Au cours de l’année d’étude, les échantillons du groupe placebo ont montré une composition stable, tant au niveau du genre Figure et niveau supplémentaire des figures A et OTU: Aucun des UTO n’a significativement changé d’abondance entre les visites de base et les autres visites. richesse en espèces le nombre de taxons ou d’UTO par échantillon Figure supplémentaire A, ni dans l’indice de dominance qui reflète la distribution des taxons Figure B supplémentaire

Tableau Nombre d’unités taxonomiques opérationnelles par groupe de traitement ayant changé statistiquement significativement de leur abondance au fil du temps Échantillon Paire Placebo Ciprofloxacine Clindamycine Jour de base Mois de référence Mois de référence Mois de référence Mois de référence Mois Mois Échantillon Paire Placebo Ciprofloxacine Clindamycine Jour de référence Niveau de référence mois Mois de référence -mois Baseline-mois Baseline-mois un test t apparié-échantillons, P & lt; , après correction pour des comparaisons multiples en utilisant le taux de fausses découvertes

Figure Vue largeTélécharger la diapositiveA-J, Effets des traitements placebo, ciprofloxacine et clindamycine sur les proportions des principaux genres ou taxons supérieurs dans les échantillons de microbiomes fécaux dans le temps Seuls les taxons qui ont montré des changements statistiquement significatifs en raison de l’exposition à l’un des antibiotiques en comparaison avec le groupe placebo ont été inclus dans la figure Les astérisques indiquent la proportion statistiquement significativement différente du genre respectif à l’heure respective par rapport au groupe placebo P & lt; , Test de Mann-Whitney; ajusté pour des comparaisons multiples en utilisant la correction de Bonferroni Abréviations: BL, ligne de base; D, jour; M, mois; M, mois; M, mois; M, mois Figure Vue grandDownload slideA-J, Effets des traitements placebo, ciprofloxacine et clindamycine sur les proportions des principaux genres ou taxons supérieurs dans les échantillons de microbiomes fécaux dans le temps Seuls les taxons qui ont montré des changements statistiquement significatifs en raison de l’exposition à un des antibiotiques par rapport au groupe placebo ont été inclus dans la figure Les astérisques indiquent la proportion statistiquement significativement différente du genre respectif au moment de la prise en charge par rapport au groupe placebo P & lt; , Test de Mann-Whitney; ajusté pour des comparaisons multiples en utilisant la correction de Bonferroni Abréviations: BL, ligne de base; D, jour; M, mois; M, mois; M, mois; M, mois

Composition quantitative du microbiote intestinal dans le groupe ciprofloxacine

Les résultats des cultures quantitatives de microorganismes aérobies et anaérobies intestinaux sont présentés sur la Figure Il y avait une diminution des bactéries aérobies à Gram négatif directement après le jour, mais cela s’est normalisé au mois. Figure A Les bactéries aérobies gram-positives étaient stables jusqu’au jour. Figure B Les valeurs médianes pour la ligne de base, le jour, le mois, le mois, le mois et le mois étaient,,,,, et, respectivement. Une diminution des bactéries anaérobies gram-positives a été observée directement après le jour. Figure D Aucun changement concernant les bactéries anaérobies Gram négatif n’a été observé. Figure C Aucune bactérie Clostridium difficile n’a été retrouvée dans les échantillons fécaux. Parmi les bactéries aérobies gram-positives et gram-négatives du groupe ciprofloxacine, Escherichia coli a diminué directement après le jour. mois Les nombres d’entérocoques étaient stables jusqu’au mois, augmentaient au mois et diminuaient lentement jusqu’à la normale l niveaux au mois Une diminution des bifidobactéries a été observée directement après le jour du traitement Aucun changement concernant les autres bactéries n’a été observé.

Profils fécaux du microbiome avant et après l’administration de la ciprofloxacine

L’administration de la ciprofloxacine a entraîné une nette modification de la population microbienne au niveau du genre et de la figure supplémentaire B, la variation la plus marquée de la composition étant observée au mois. La proportion du genre Bacteroides augmentait significativement de A à G, tandis que celle du genre Faecalibacterium Figure B et Alistipes Figure F et Ruminococcaceae non cultivées Figure D a montré une diminution significative de leur proportion au mois Au niveau OTU, pas de changements significatifs ont été observés sur le jour Tableau Les effets les plus prononcés ont été observés à nouveau au mois, où OTU Table et Tableau supplémentaire diminué significativement dans leur proportion par rapport aux échantillons de référence Huit des UTO affectés appartenaient à différents membres de l’ordre Clostridiales, à l’ordre des Bacteroidales, et à la famille Erysipelotrichaceae Tableau supplémentaire Les effets significatifs sur les OTUs ont été observés pendant toute la période d’étude, avec un seul OTU étant affecté même au mois Tableau La richesse spécifique ou le nombre de taxons a diminué significativement déjà le jour et est resté réduit jusqu’au mois. Figure A L’indice de dominance Figure C supplémentaire a été significativement réduit jusqu’au mois par rapport aux échantillons de référence respectifs, et jusqu’au mois vs le même temps dans le groupe placebo

Composition quantitative du microbiote intestinal dans le groupe de la clindamycine

Les résultats des cultures quantitatives de microorganismes aérobies et anaérobies intestinaux sont présentés sur la figure. Aucun changement concernant les bactéries aérobies ou anaérobies à Gram négatif n’a été observé. Figure A et CA diminution des bactéries aérobies Gram positif a été observée directement après le jour Figure B Les valeurs médianes pour Le nombre de bactéries anaérobies gram-positives a diminué directement après le traitement et ne s’est normalisé qu’à la fin de l’étude, c.-à-d. le mois. les valeurs de référence, jour, mois, mois, mois et mois étaient,,,,, et, respectivement, Aucune souche de C difficile n’a été retrouvée dans les échantillons fécaux. Parmi les bactéries aérobies et anaérobies gram-positives du groupe clindamycine, une diminution de lactobacilles et d’entérocoques a été observé directement après le jour de la prise. Le nombre de bifidobactéries a diminué directement après le traitement et ne s’est normalisé anges concernant d’autres bactéries ont été observées les données du genre et des espèces non montrées

Profils fécaux du microbiome avant et après l’administration de la clindamycine

L’administration de clindamycine a entraîné un net changement dans la population microbienne au niveau du genre Figure et Figure C supplémentaire Le jour, la proportion du genre Coprococcus était significativement réduite Figure H Au mois, les genres Roseburia Figure C, Lachospira Figure E, Coprococcus Figure H , Dorea Figure I, et Ruminococcus Figure J et Lachnospiraceae non cultivées Figure G ont été significativement réduits dans leur proportion par rapport au groupe placebo à ce moment-là Au niveau de l’OTU, les UTO étaient déjà significativement réduits dans leur proportion juste après l’administration de clindamycine sur Tableau et Tableau supplémentaire La majorité / de ces OTU appartenaient à l’ordre Clostridiales Les effets significatifs ont été observés jusqu’au mois, lorsque les OTU ont montré une diminution significative par rapport à la base de référence. les analyses ont montré que le nombre de richesse en espèces de O Les VAT ou les taxons étaient significativement réduits jusqu’au mois suivant la figure supplémentaire A, tandis que l’indice de dominance était significativement augmenté jusqu’au mois suivant. Figure B supplémentaire depuis l’administration de la clindamycine

DISCUSSION

Les microorganismes qui causent des infections cliniques dans de nombreux cas proviennent du microbiote normal Bien que les antibiotiques soient conçus pour tuer les agents pathogènes cibles, même les organismes sensibles du microbiote normal sont directement ou indirectement affectés Après exposition aux antibiotiques, la majeure partie du microbiote retour au niveau de pré-exposition en – semaines Ces changements dépendent du spectre d’activité, de la dose, de la voie d’administration, des propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques et de l’activité in vivo de l’antibiotique Dans la présente étude , la ciprofloxacine administrée par voie orale n’a pas eu d’impact sur les bactéries anaérobies à Gram négatif et les bactéries aérobies Gram positives. Le nombre d’aérobies à Gram négatif a diminué de façon importante au jour. Les aérobies à Gram positif sont demeurés élevés jusqu’à la fin de l’étude. anaérobies gram-positifs normalisés au mois Dans la méthode basée sur la culture classique, l’impact de la ciprofloxacine était le jour, et pyroséquençage s modification de la composition du microbiote du mois au mois La clindamycine administrée par voie orale n’a eu aucun impact sur les bactéries aérobies et anaérobies à Gram négatif. Cependant, les bactéries aérobies et anaérobies à Gram positif diminuent le jour et se normalisent d’un mois à l’autre. étude basée, l’effet de la clindamycine a été observé le jour et a été normalisé à la fin de l’étude En utilisant le pyroséquençage, les changements dans la composition microbienne ont été observés jusqu’à mois. Les spectres de la ciprofloxacine ou de la clindamycine sont larges. Infection à C difficile, colonisation par des levures et émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques dans le cadre d’un traitement antibiotique à large spectre L’ICD est un événement indésirable associé à presque tous les traitements antibiotiques à large spectre chez des patients âgés présentant d’autres facteurs confondants [- Les lactobacilles, les bifidobactéries et les Bacteroides sont des composants importants du microbiote normal y un rôle important dans la prévention des ICD [,, -] Cependant, les probiotiques pour la prévention des ICD ne sont pas bien établis Dans la présente étude, dans le groupe ciprofloxacine, les bifidobactéries diminuent le jour, mais les lactobacilles et les Bacteroides Dans le groupe de la clindamycine, les lactobacilles et les bifidobactéries diminuent au jour Lactobacilli normalisé au mois, mais les bifidobactéries ne se normalisent pas jusqu’à la fin de l’étude. Il est bien documenté que la clindamycine cause des ICD. Cependant, la ciprofloxacine n’est pas aussi concluante. ,,] Dans la présente étude, aucun C difficile n’a été retrouvé à partir des échantillons de n’importe quel volontaire. Le CDI n’est pas une menace majeure pour la population adulte jeune et en bonne santé [,,] Les concentrations de ciprofloxacine ou de clindamycine dans les fèces dépassaient les concentrations minimales inhibitrices pour la plupart des bactéries, ce qui explique l’effet sur le microbiote intestinal juste après l’administration des antibiotiques; En conclusion, l’intervalle nécessaire pour que le microbiote normal soit normalisé après le traitement par la ciprofloxacine ou la clindamycine est différent pour diverses espèces bactériennes. Il faut plusieurs mois pour normaliser le microbiote humain après l’administration des agents dans le placebo. groupe, les changements dans le microbiote intestinal étaient dans la fourchette normale et la composition était stable Les données de méthodes basées sur la culture donnent des nombres absolus alors que les données de pyroséquençage donnent des nombres proportionnels du microbiote Pour les différentes approches, l’impact a été vu le jour. Méthodes basées sur la culture et avec la méthode de pyroséquençage par mois L’effet de la ciprofloxacine et de la clindamycine sur le microbiote fécal normal a été observé jusqu’à plusieurs mois après le traitement en utilisant des méthodes conventionnelles ou de pyroséquençage.

Données supplémentaires

Les documents supplémentaires sont disponibles à Clinical Infectious Diseases en ligne http: // cidoxfordjournalsorg Les documents supplémentaires sont constitués de données fournies par l’auteur qui sont publiées au profit du lecteur Les documents affichés ne sont pas copiés Le contenu de toutes les données supplémentaires sont de la seule responsabilité des auteurs ou les messages concernant les erreurs doivent être adressés à l’auteur

Remarques

Remerciements Ce travail a été soutenu par le septième programme-cadre de l’Union européenne FP / -; Numéro de l’accord de subvention Supplément de parrainage Cet article est apparu dans le supplément “Probiotiques: valeur ajoutée supplémentaire dans Clostridium difficile Infection”, parrainé par Bio-K Plus InternationalPotentiel conflits d’intérêts Tous les auteurs: Aucun conflit signaléTous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation de Conflits d’intérêts potentiels Les conflits que les éditeurs jugent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués