Contributions sérodiagnostiques des titres d’anticorps contre les antigènes lipidiques mycobactériens dans la maladie pulmonaire Mycobacterium avium

Contexte Bien que l’incidence de la tuberculose pulmonaire diminue, le nombre de patients immunocompétents atteints d’une maladie pulmonaire à MAC complexe de Mycobacterium avium augmente régulièrement. Par conséquent, même si elle n’est pas contagieuse, la maladie pulmonaire MAC doit être diagnostiquée rapidement et avec précision. Des échantillons de sérum ont été prélevés chez des patients atteints de maladie pulmonaire MAC, chez des patients suspects de MAC, chez des patients atteints de tuberculose pulmonaire, chez des patients atteints de la maladie de Mycobacterium kansasii et chez des patients sains, chez des patients atteints d’une maladie pulmonaire mycobactérienne. volontaires contrôlent les sujets Nous avons mesuré les titres sériques d’anticorps anti-immunoglobulines G contre le tréhalose monomycolate TMM-M et apolaire-glycopeptidolipide GPL, les antigènes lipidiques extraits de MACResults Chez les patients atteints de maladie pulmonaire MAC, les titres d’anticorps contre TMM-M et apolar-GPL étaient signe Par analyse de courbe caractéristique de l’opérateur récepteur, une densité optique de, correspondant au titre d’anticorps cutoff optimal contre TMM-M, a été associée à une sensibilité de% et une spécificité de% et une densité optique de, correspondant au titre d’anticorps de coupure optimale contre la GPL apolaire, a été associée à une sensibilité de% et à une spécificité de% Conclusions Des mesures de titres d’anticorps contre TMM-M et apolaire-GPL seraient utiles dans le diagnostic de la maladie pulmonaire MAC et dans le diagnostic différentiel de la maladie pulmonaire mycobactérienne

Les manifestations cliniques uniques des infections pulmonaires dues au MAC Mycobacterium avium, un pathogène opportuniste largement répandu dans le sol et l’eau dans le monde, ont récemment attiré l’attention Avec un nombre croissant de patients immunocompétents présentant une maladie pulmonaire MAC, un diagnostic précoce et précis est devenu particulièrement important Cependant, en raison de la similitude radiologique entre la maladie MAC et d’autres maladies pulmonaires mycobactériennes, telles que la tuberculose pulmonaire ou Mycobacterium kansasii, un diagnostic précis peut être difficile Dans certains cas, la présentation de la maladie ne remplit pas les critères diagnostiques l’American Thoracic Society ou les lignes directrices de l’Infectious Diseases Society of America, bien qu’il soit compatible avec les caractéristiques cliniques et radiologiques spécifiques de la maladie pulmonaire MAC En outre, une distinction claire entre la maladie pulmonaire MAC et la tuberculose pulmonaire est essentielle. Des études récentes ont montré l’utilité du sérodiagnostic de la maladie pulmonaire MAC Kitada et al ont utilisé les mesures des titres d’anticorps anti-immunoglobulines Ig A sériques contre le core-glycopeptidolipide. GPL Fujita et al ont rapporté que les réponses immunitaires humorales mesurées par ELISA en utilisant des antigènes lipidiques mycobactériens, le phosphatidylinositol dimannoside PL-, le tréhalose, le ‘- dimycolate et le tréhalose monomycolate de Mycobacterium bovis bacillus Calmette- Guérin et b tréhalose monomycolate TMM-M et core-GPL de MAC, pourraient distinguer de manière fiable les sujets témoins sains des patients atteints de tuberculose pulmonaire ou de MAC maladie Dans la présente étude, nous avons purifié apolar-GPL, un antigène spécifique de l’espèce et serotype-commun, de Cellules tuées par la chaleur de MAC, qui possède, -di O-méthyl rhamnose et -désoxytalose comme MAC glucide commun e Matsunaga et al ont observé une réponse IgG à la GPL apolaire chez des cobayes infectés par MAC Nous rapportons ici la contribution des titres d’anticorps IgG sériques contre TMM-M et apolar-GPL dans le diagnostic de maladie pulmonaire MAC versus maladie pulmonaire due à M kansasii ou Mycobacterium tuberculosis

Méthodes

Groupes d’étude Les groupes d’étude comprenaient des patients atteints de maladie pulmonaire MAC, des patients suspects de MAC, des patients atteints de tuberculose pulmonaire et des patients atteints de maladie pulmonaire M kansasii admis à l’hôpital universitaire Keio d’octobre à décembre et des volontaires sains après les patients. Les patients ayant des antécédents de tuberculose ou d’infection par le virus de l’immunodéficience humaine VIH ou qui ont reçu une chimiothérapie pour des troubles malins ou un traitement par la prednisone à un dosage de & gt; mg / jour pour & gt; mois ont été exclus de l’étude Les patients n’étaient pas traités pour la maladie mycobactérienne au moment de la collecte des échantillons de sérum

Caractéristiques de sujets dans l’étudeLes diagnostics de MAC et M kansasii maladie pulmonaire ont été basées sur les lignes directrices publiées par l’American Thoracic Society Les cultures ont été réalisées en utilisant le Bactec MGIT système de détection des mycobactéries Becton Dickinson Systèmes de microbiologie, y compris sl ovule solide à base d’œuf Les colonies formées sur chaque culture ont été identifiées à l’aide d’un kit de confirmation de culture Accuprobe Gen-Probe, du test de réaction en chaîne Amplicor polymérase Roche Diagnostic System et de la méthode d’hybridation ADN-ADN Kyokuto Pharmaceutical dans les échantillons provenant de patients atteints de maladie pulmonaire MAC inclus M avium et Mycobacterium intracellulare Les patients qui remplissaient les critères cliniques et radiographiques mais pas les critères microbiologiques formulés dans les lignes directrices de l’American Thoracic Society ont été classés comme suspects de maladie pulmonaire MAC Les volontaires sains étaient des agents de santé de l’hôpital universitaire Keio qui n’avaient pas d’antécédents de maladie mycobactérienne et ont accepté de participer au groupe témoin. Cette étude était conforme à la Déclaration d’Helsinki et a été approuvée par le comité d’éthique l’École de Médecine de l’Université Keio et l’hôpitalAntigens TMM-M, apolaire-GPL, et PL-, un antigène commun mycobactérien, ont été isolés comme décrit dans un rapport précédent Brièvement, les lipides ont été extraits des cellules tassées avec un chloroforme-méthanol On évapore les lipides par fractionnement par solvant dans des fractions solubles dans l’acétone, solubles dans le méthanol ou solubles dans le tétrahydrofurane et on les sépare ensuite par Chromatographie en couche mince sur gel de silice. Uniplates Analtech avec un système solvant de chloroforme-méthanol – eau vol / vol / vol, :: ou :: pour isoler les antigènes lipidiques PL-, TMM-M, et apolar-GPL Chaque composant, tel que les sucres ou les acides gras, a été analysé par chromatographie en phase gazeuse et / ou spectrométrie de masse. Sur la base de tests préliminaires, en utilisant un test ELISA des données sur les antigènes lipidiques mycobactériens. pas montré, nous avons choisi PL-, TMM-M, et apolar-GPL pour le diagnostic du système de microplaque MACISA pour les titres de l’anticorps IgG contre les titres d’anticorps IgG PL-, TMM-M et apolaire-GPL contre PL-, TMM- M, et apolaire-GPL, déterminé par un système de microplaque ELISA, ont été mesurés comme décrit dans un rapport précédent TMM-M a été dissous dans n-hexane μg d’antigène dans μL de n-hexane par puits, et PL- et apolaire -GPL ont été dissous dans un mélange n-hexane-éthanol vol / vol,:; Un antigène a été déposé dans un puits de microplaque en polystyrène Nunc-Immunoplate Nalge Nunc International, et les plaques ont été laissées sécher pendant une nuit à température ambiante. Les plaques ont été utilisées immédiatement ou ont été scellées dans un puits de microplaque. En utilisant des échantillons identiques, aucune différence n’a été observée entre les résultats obtenus avec des plaques utilisées immédiatement et les résultats obtenus avec des plaques conservées pour des données mensuelles non montrées. Pour ELISA, la liaison non spécifique a été bloquée en utilisant μL / puits de% Tween dans une solution saline tris tamponnée TBS-T à pH ajusté avec HCl, et la plaque a été incubée pendant min à température ambiante. Les échantillons testés pour les anticorps dans le sérum ont été dilués: avec TBS-T L’échantillon dilué à μL / puits a été ajouté La plaque a été incubée pour H IgM anti-humain de chèvre AffiniPure conjugué à la peroxydase HL Beckman Coulter, dilué: dans du TBS-T, a été utilisé comme anticorps secondaire après incubati dessus pour, SureBlue TMB -Component Microwell Peroxydase Substrat Kirkegaard & amp; La réaction a été arrêtée avec du HCl N et l’absorption a été mesurée dans un lecteur de microplaques NPR-Ai Tosoh Corporation à – nm. Les plaques ont été incubées à température ambiante et, après chaque étape opératoire, ont été lavées avec TBS-TStatistical Méthodes Les comparaisons de données entre patients et volontaires sains ont été faites par analyse de variance et tests non paramétriques Les titres cutoff optimaux pour TMM-M et apolar-GPL, associés à la plus haute sensibilité diagnostique et spécificité pour détecter une maladie pulmonaire MAC, et% IC intervalles de confiance Les corrélations potentielles entre les titres des anticorps anti-TMM-M et anti-apolaire-GPL ont été examinées par la méthode de rang de Spearman avec les données des patients. avec MAC maladie pulmonaire Les données ont été analysées avec le logiciel GraphPad Prism, version GraphPad Logiciel A P valeur & lt; a été considéré comme statistiquement significatif

Résultats

Caractéristiques démographiques des groupes d’étude L’âge moyen des patients atteints de MAC maladie pulmonaire était de quelques années, et la durée moyenne de la maladie ± écart-type était de ± ans, mois-années. En moyenne, les patients atteints de tuberculose pulmonaire et la Des différences significatives dans la répartition des sexes ont également été observées entre les patients atteints de maladie pulmonaire MAC et les patients atteints de tuberculose et de maladie de Kansasii. Répartition des titres d’anticorps IgG anti-antigène lipidique chez les patients et les sujets témoins contient des diagrammes de dispersion des titres d’anticorps IgG contre PL-, TMM-M et apolaire-GPL chez les patients atteints de MAC, suspicion de MAC, tuberculose pulmonaire et maladie pulmonaire M kansasii et chez des volontaires sains Aucune différence significative dans les anticorps IgG sériques des titres contre PL- ont été observés parmi les groupes de patients; Plus précisément, la moyenne + écart-type de la densité optique était de ± chez les patients atteints de maladie pulmonaire MAC, ± chez les patients suspects de MAC, ± chez les patients atteints de tuberculose pulmonaire et ± chez les patients atteints de maladie pulmonaire M kansasii. Le PL-, mesuré par la densité optique, était significativement plus élevé P & lt; chez les patients atteints d’une maladie pulmonaire MAC ± que chez les volontaires sains ± Les titres d’anticorps IgG sériques contre TMM-M étaient significativement plus élevés chez les patients atteints de maladie pulmonaire MAC que dans tous les autres groupes de l’étude; en particulier, la densité optique moyenne était ± chez les patients atteints de maladie pulmonaire MAC, ± chez les patients suspects de MAC, ± chez les patients atteints de tuberculose pulmonaire, ± chez les patients atteints de kansasii pulmonaire et ± chez les volontaires sains P & lt; De même, les titres d’anticorps IgG sériques contre la GPL apolaire étaient significativement plus élevés chez les patients atteints de maladie pulmonaire MAC que dans tous les autres groupes de l’étude. La densité optique moyenne chez les patients atteints de maladie pulmonaire MAC était de ± avec ± chez les patients suspects de MAC, ± chez les patients atteints de tuberculose pulmonaire, ± chez les patients atteints de maladie pulmonaire M kansasii et chez les volontaires sains P & lt; pour chaque comparaison entre patients atteints de maladie pulmonaire MAC et tous les autres groupes d’étude. les mesures des titres d’anticorps IgG sériques contre TMM-M et apolaire-GPL pourraient être utiles dans le diagnostic de la maladie pulmonaire MAC, ainsi que pour le diagnostic différentiel de la mycobactériose pulmonaire Nous n’avons trouvé aucune corrélation statistique entre les titres d’anticorps sériques contre TMM-M ou apolaire-GPL et l’âge, la durée de la maladie ou l’administration d’un traitement antérieur chez les patients atteints de MAC

Figure Vue en grandDimension des titres des anticorps IgG contre le phosphatidylinositol dimannoside PL-A, le tréhalose monomycolate TMM-M du complexe Mycobacterium avium MAC B et la glycémie apolaire-glycopeptidolipidique du MAC C dans les échantillons sériques obtenus chez des patients atteints de MAC maladie pulmonaire «MAC» , les patients atteints de la maladie suspecte MAC «susp MAC», les patients atteints de tuberculose pulmonaire «TB», les patients atteints de la maladie pulmonaire Mycobacterium kansasii “M kansasii”, et les volontaires sains “contrôle” Les lignes horizontales montrent les titres d’anticorps IgG moyenne pour chaque groupe. Les patients et le groupe de contrôle ont été faits par analyse de variance et analyse non paramétrique * P & lt; Figure Voir grandDownloadtogrammes des titres d’anticorps IgG anti-immunoglobuline contre le phosphatidylinositol dimannoside PL-A, le tréhalose monomycolate TMM-M du complexe Mycobacterium avium MAC B et apolaire-glycopeptidolipide GPL de MAC C dans des échantillons de sérum obtenus à partir de pa patients atteints de MAC maladie pulmonaire “MAC”, les patients atteints de suspicion MAC maladie “susp MAC”, les patients atteints de tuberculose pulmonaire “TB”, les patients atteints de la maladie pulmonaire Mycobacterium kansasii “M kansasii”, et des volontaires sains “contrôle” Les lignes horizontales montrent la moyenne Titres d’anticorps IgG pour chaque groupe Les comparaisons entre les patients et le groupe témoin ont été faites par analyse de variance et analyse non paramétrique. Les valeurs de coupure optimales pour les titres d’anticorps sériques contre TMM-M et apolar-GPL La précision des mesures des titres d’anticorps sériques contre TMM -M et apolaire-GPL et les valeurs seuils associées à la sensibilité et la spécificité les plus élevées chez les patients atteints de maladie pulmonaire MAC ont été examinées par l’analyse de courbe caractéristique de l’opérateur récepteur Fig Analyse des titres d’anticorps sériques contre TMM-M révélé une densité optique de coupure optimale de, associée à une sensibilité de%% CI,% -% et une spécificité de%% CI,% -% Analyse du sérum anti les titres corporels contre apolar-GPL ont révélé une densité optique de coupure optimale de, associée à une sensibilité de%% CI,% -% et une spécificité de%% CI,% -%

Figure Vue grandDownload slideCaractéristiques de l’opérateur récepteur construites en utilisant les titres d’anticorps sériques contre le tréhalose monomycolate du complexe Mycobacterium avium MAC A et apolaire-glycopeptidolipide de MAC B dans les échantillons obtenus chez tous les patients atteints de maladie pulmonaire MAC, par rapport aux sujets témoins sains. courbes construites en utilisant les titres d’anticorps sériques contre le tréhalose monomycolate du complexe Mycobacterium avium MAC A et apolaire-glycopeptidolipide de MAC B dans des échantillons obtenus chez tous les patients atteints de maladie pulmonaire MAC, comparés à des sujets témoins sainsCorrélation entre les titres anti-TMM-M et anti- anticorps anti-GPL apolaires chez les patients Nous avons trouvé une forte corrélation positive entre les titres des anticorps anti-TMM-M et anti-polaire-GPL r =; P & lt; Bien que la plupart des patients atteints de la maladie pulmonaire MAC avaient des titres élevés pour les deux anticorps, quelques patients avaient des titres élevés pour un seul anticorps Fig MAC maladie pulmonaire a récemment été classés en sous-types distincts: maladie fibrocavitaire et maladie nodulaire bronchique avec la maladie pulmonaire MAC avait une maladie fibrocavitaire, tous les patients avec des titres élevés pour un seul anticorps avaient une maladie nodulaire-bronchectasique

Figure Vue largeDownload slide Corrélation positive entre les titres du monomycolate anti-tréhalose du complexe Mycobacterium avium TMM-M et des anticorps anti-GPL anti-apolaires r =; P & lt; Figure View largeDownload slide Corrélation positive entre les titres du monomycolate anti-tréhalose du complexe Mycobacterium avium TMM-M et des anticorps GPL anti-apolaires-glycopeptidolipides r =; P & lt;

Discussion

Étant donné que la tuberculose pulmonaire présente des titres élevés d’anticorps contre le TMM-M. Comme le tréhalose monomycolate de M tuberculosis et le MAC, TMM-M partagent plusieurs sous-classes d’acides mycoliques, y compris alpha-, méthoxy- et céto-mycolates dans M tuberculosis avec alpha-, céto-, et cires-mycolates dans MAC, la réactivité croisée partielle contre TMM-M des échantillons sériques de patients atteints de tuberculose doit être prise en considérationUn essai de libération d’interféron-y utilisant plusieurs antigènes spécifiques de la tuberculose M basés sur l’immunité à médiation cellulaire Bien qu’elle représente de grands progrès dans le diagnostic et l’évaluation épidémiologique de la tuberculose latente, elle n’exclut peut-être pas la coexistence de la tuberculose et de l’infection MAC Bien que tuberculose et maladies pulmonaires MAC partagent des caractéristiques cliniques similaires, leurs étiologies immunopathologiques diffèrent notablement. L’infection à M tuberculosis induit des réponses immunitaires de type Th proéminentes , alors que la MAC Les observations expérimentales faites in vivo ont montré que l’efficacité de la vaccination contre le bacille de Calmette-Guérin est limitée par une pré-exposition ou une pré-infection avec des souches de MAC Par conséquent, la pré-exposition ou la pré-MAC peuvent diminuer – réguler la production d’interféron-γ en réponse aux antigènes protéiques spécifiques à M tuberculosis, bien qu’ils ne soient pas produits par le bacille Calmette-Guérin De ce point de vue, outre le sérodiagnostic précoce précoce du MAC et de la tuberculose, il est important de confirmer la coexistence Chez les patients atteints de bronchiectasie, les voies respiratoires peuvent être infectées par le MAC en l’absence d’invasion tissulaire, une condition appelée «colonisation» dans un modèle in vitro pour étudier l’interaction des mycobactéries avec le virus. muqueuse respiratoire humaine, Middleton et al ont observé la multiplication de MAC en colonies discrètes sur la surface de la muqueuse respiratoire. Les observations pathologiques et radiologiques ont révélé que la bronchectasie ou la bronchiolite causée par l’infection par MAC sont le résultat de la destruction de la structure bronchique Les patients atteints d’une MAC suspectée qui remplissent les critères cliniques et radiographiques mais pas les Des critères microbiologiques formulés par les directives de la American Thoracic Society pourraient ultérieurement développer une maladie pulmonaire MAC. Un patient avec des titres élevés d’anticorps contre TMM-M et apolar-GPL, pour lesquels la MAC avait été suspectée depuis des années, souffrait d’une maladie pulmonaire MAC Par conséquent, nous croyons que certains des patients qui ont des titres élevés pour les anticorps contre TMM-M et apolaire-GPL sont susceptibles de développer une maladie pulmonaire manifeste, bien que notre hypothèse doit être confirmée par prospective supplémentaire, longue observations à long termeLe sérodiagnostic de la maladie pulmonaire MAC offre plusieurs Avantages potentiels Le test serait un outil d’appoint particulièrement utile pour confirmer le diagnostic de maladie pulmonaire MAC quand il est suspecté. La détection sérodiagnostique de l’infection par MAC serait également importante, car le MAC coexiste souvent avec le VIH dans les stades avancés du SIDA. d’anticorps contre le core-GPL est altérée , ou avec la tuberculose pharmacorésistante dans les stades précoces ou tardifs de la maladie Dans leur dernière déclaration concernant le traitement des mycobactéries non tuberculeuses, l’American Thoracic Society et l’Infectious Diseases Society of America suggèrent que La question de la co-infection avec MAC et d’autres organismes devrait être étudiée Un sérodiagnostic fiable permettrait de suspecter une co-infection avec MAC chez des patients atteints de bronchiectasie, y compris lorsque d’autres microorganismes, tels que Pseudomonas aeruginosa, sont présents dans les expectorations. l’état immunitaire de l’hôte, plusieurs facteurs doivent être examinés, tels que les effets de la durée de l’incubation de la maladie et de la chimiothérapie anti-MAC sur la production d’anticorpsUne petite limite de notre étude est le petit nombre d’individus dans chaque groupe Il est nécessaire d’étudier des populations plus importantes sur plusieurs sites avec différents contextes cliniques et géographiques. dans les titres pour les anticorps contre TMM-M et apolar-GPL pour les patients atteints de maladie pulmonaire MAC, nous avons constaté que, chez certains patients, les titres de ces anticorps étaient corrélés avec les activités cliniques évaluées par des paramètres cliniques, microbiologiques et radiographiques. Des mesures sérologiques seraient utiles non seulement pour prédire l’activité de la maladie, mais aussi pour évaluer l’efficacité chimiothérapeutique. En conséquence, des études cliniques pour examiner ces objectifs devraient être planifiées. En conclusion, les mesures des titres d’anticorps contre TMM-M et apolaire-GPL seraient utiles MAC maladie pulmonaire et dans le diagnostic différentiel de la maladie pulmonaire mycobactérienne maladie

Remerciements

Nous remercions les travailleurs de la santé de l’hôpital universitaire de Keio qui se sont portés volontaires pour cette étude Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: aucun conflit